低劑量雙酚A通過調(diào)控PPARγ致小鼠糖脂代謝紊亂的研究

龍 子，樊雋澍，吳光源，王 欣*，海春旭*

(空軍軍醫(yī)大學軍事預(yù)防醫(yī)學院毒理學教研室，特殊作業(yè)環(huán)境危害評估與防治教育部重點實驗室，陜西省自由基生物學與醫(yī)學重點實驗室，陜西 西安 710032)

自20世紀90年代以來，以非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)為代表的代謝性疾病發(fā)病率急劇上升，并且患病人數(shù)仍在逐年增加。NAFLD的特征是肝臟存在脂肪異位和脂肪變性[1]。其病理特征包括從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)等多種改變，可發(fā)展為肝硬化等終末期肝臟疾病，甚至能夠?qū)е赂渭毎?hepatocellular carcinoma，HCC)[2]。然而，NAFLD等代謝性疾病發(fā)病率升高的原因尚不清楚。大多數(shù)相關(guān)研究將高熱量飲食和不健康的生活方式作為關(guān)注點，但隨著社會的發(fā)展，人們逐漸意識到環(huán)境因素在代謝性疾病中起到的重要作用[3]。最近的流行病學、動物實驗以及臨床研究表明，一些環(huán)境污染物可能對人體內(nèi)分泌和代謝功能產(chǎn)生嚴重影響，從而促進代謝性疾病的發(fā)生[4]。

在代謝性疾病發(fā)病率快速上升之前，以雙酚A(bisphenol A，BPA)為代表的合成化學品的種類和用量呈指數(shù)級增長[5]。BPA于1891年首次合成，1957年開始用于制作塑料瓶的材料，從此，BPA成為了聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂制造中使用最廣泛、合成最方便的增塑劑之一。BPA是一種典型的內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemical，EDC)，在體內(nèi)可能發(fā)揮了雌激素類似物的作用[6]。BPA具有高親脂性，容易蓄積在脂肪組織及細胞內(nèi)。有研究表明，高脂飲食(high fat diet，HFD)喂養(yǎng)的小鼠與標準飲食喂養(yǎng)的小鼠間存在代謝方面的差異[7]。因此，我們將BPA暴露的小鼠聯(lián)合HFD喂養(yǎng)，觀察二者是否存在協(xié)同作用。

許多日常生活用品中都有BPA的存在，如嬰兒奶瓶、醫(yī)療材料、牙科設(shè)備和熱敏紙(例如收據(jù)和機票)等[6，8]。BPA在日常飲用水中的濃度為0.014～0.317 μg/L，在塑料材質(zhì)包裝的瓶裝水中的濃度為0.07～4.21 μg/L[9-10]。由于人類接觸BPA的途徑非常廣泛，因此在普通人體的血漿、尿液甚至母乳中都能夠檢測到其存在[6，11-13]。研究表明，人群血清中的BPA水平在0.000 2～66 ng/mL的范圍之間[14-17]。美國環(huán)境保護署制定的BPA每日可耐受攝入量(tolerable daily intake，TDI)為50 μg/(kg·d)，但最近的研究表明，目前世界上現(xiàn)有安全限值以下劑量的BPA暴露同樣有可能對于民眾的健康產(chǎn)生損害效應(yīng)。因此，低劑量BPA暴露對機體的影響仍有待進一步研究。

現(xiàn)階段的研究結(jié)果提示，BPA能夠影響發(fā)育水平[18]，降低生育能力[19-20]和誘發(fā)肥胖[21]，導致包括NAFLD在內(nèi)的代謝疾病[22-23]，甚至癌癥[24]。但BPA暴露能否導致肝臟發(fā)生糖脂代謝紊亂及其相關(guān)機制仍不清楚。本研究設(shè)計了體內(nèi)及體外實驗來研究BPA暴露對糖脂代謝功能的影響，揭示BPA暴露與糖脂代謝紊亂的關(guān)系及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

實驗中所用C57BL/6J雄性小鼠購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心；BPA購自美國Sigma公司；HFD飼料購自江蘇美迪森公司；人參皂苷Rh1(Rh1)購自美國MCE公司；BODIPY 493/503染料購自美國Invitrogen公司；L02細胞購自ATCC；棕櫚酸(palmitic acid，PA)購自美國Sigma公司。

1.2 實驗分組與動物模型

所有實驗均按照空軍軍醫(yī)大學動物福利和使用委員會批準的程序進行。小鼠在恒溫[(23±1)℃]和恒濕[(55±5)%]條件下飼養(yǎng)，并遵循嚴格的12 h/12 h明暗周期。為了盡量減少實驗處理之外的BPA暴露，我們使用聚苯乙烯鼠籠飼養(yǎng)動物。將60只小鼠隨機分為5組：對照組及1、10、100、1 000 μg/(kg ·d)BPA組。BPA組每天分別按照相應(yīng)劑量灌胃給藥，暴露時間為8周。測定脂質(zhì)積累相關(guān)指標后，選擇變化最為明顯的劑量組作為本研究的實驗劑量進行后續(xù)研究。將另外60只小鼠隨機分為5組：對照組、HFD組、BPA組、BPA聯(lián)合HFD組、BPA聯(lián)合Rh1組。HFD組與BPA聯(lián)合HFD組在飼養(yǎng)過程中使用脂肪含量為45%的高脂飼料喂養(yǎng)8周。BPA組、BPA聯(lián)合HFD組及BPA聯(lián)合Rh1組給予10 μg/(kg·d)BPA灌胃給藥處理。從BPA給藥的第5周開始，BPA聯(lián)合Rh1組同時給予20 mg/(kg·d)Rh1灌胃處理，給藥時間為4周。處理結(jié)束后，將小鼠禁食8 h，用戊巴比妥鈉麻醉，實施安樂死后收集血清，稱取肝組織質(zhì)量，制作肝組織病理切片及冰凍切片，將剩余肝組織冷凍于-80℃冰箱保存待用。

1.3 空腹血糖水平、IPGTT和IPITT實驗

在實施安樂死前，采用剪尾法測定小鼠空腹血糖水平。腹腔糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)用于檢測葡萄糖負荷對代謝活動的影響，腹腔胰島素耐量實驗(intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT)用于測定小鼠的胰島素抵抗程度。IPGTT和IPITT實驗在動物安樂死前1周進行，兩次實驗之間有3 d的間隔。禁食8 h后，測定小鼠尾靜脈血液的基礎(chǔ)血糖水平，使用1 g/kg的D-葡萄糖溶液或0.75 U/kg的胰島素進行腹腔內(nèi)注射，分別在注射后30、60和120 min測量血糖水平，并計算曲線下面積。

1.4 肝組織生化測定

使用甘油三酯(triglyceride，TG)檢測試劑盒，采用比色法測定肝臟中TG水平。

1.5 細胞培養(yǎng)及處理

L02細胞使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基，在37℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下進行培養(yǎng)。細胞使用1或10 μmol/L的BPA培養(yǎng)48 h后進行處理。20 μmol/L的PA處理24 h用于促進L02細胞脂質(zhì)積累。使用100 μmol/L的Rh1處理24 h抑制過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)的生成。

1.6 葡萄糖吸收水平檢測

L02細胞使用1或10 μmol/L的BPA處理48 h后，采用2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazol-4-yl)amino]-2-deoxyglucose(2-NBDG)法測定細胞的葡萄糖吸收程度。將L02細胞與2-NBDG熒光劑(使用無葡萄糖培養(yǎng)基稀釋，終濃度為100 μg/mL)在100 μmol/L胰島素的條件下，在37℃孵箱內(nèi)孵育30 min(根據(jù)不同實驗條件，最多可孵育至16 h)。在BPA處理24 h后，使用BPA和100 μmol/L Rh1繼續(xù)共處理24 h。使用全波段酶標儀測定2-NBDG的含量。

1.7 脂肪酸吸收水平檢測

采用脂肪酸吸收測定試劑盒測定L02細胞脂肪酸吸收水平。將細胞用1或10 μmol/L BPA處理48 h，在BPA處理24 h后，使用BPA和100 μmol/L Rh1共處理或使用BPA和20 μmol/L PA共處理24 h。將每組樣品在無血清培養(yǎng)基中饑餓處理1 h。處理完成后，將100 μL脂肪酸染料稀釋液加入樣品中，繼續(xù)孵育60 min。使用全波段酶標儀測定樣品熒光強度。

1.8 肝組織及細胞染色

將肝組織固定在4%多聚甲醛溶液中，用石蠟包埋。使用蘇木精和伊紅染液按照標準步驟對石蠟包埋組織切片進行HE染色。為了檢測組織或細胞中的脂質(zhì)積累，使用冰凍切片進行油紅O染色。使用4%多聚甲醛固定L02細胞或小鼠肝組織，用BODIPY 493/503染料進行熒光染色。使用光學顯微鏡觀察HE和油紅O的染色情況，使用激光共聚焦顯微鏡觀察BODIPY染色情況。

1.9 糖原含量測定

采用糖原含量檢測試劑盒，通過比色法檢測小鼠肝組織和L02細胞中的糖原含量。

1.1 0 實時熒光定量PCR

小鼠肝組織和L02細胞中的RNA使用總RNA提取試劑盒進行分離。使用TaKaRa PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒將500 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)試劑使用SYBR Green PCR試劑盒，取1 μL cDNA用于20 μL反應(yīng)體系。引物信息見表1。PCR反應(yīng)過程的簡要說明如下：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1 min(以上3步進行30個循環(huán))；在72℃下延伸5 min。mRNA的相對含量使用法計算，β-actin用作內(nèi)參。

表1 引物信息

1.11 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)表示為±s。兩組之間差異的分析采用t檢驗。使用單因素方差分析(ANOVA)計算多組間的差異，如差異有統(tǒng)計學意義，則使用Newman-Keuls法進行兩兩組間的比較分析。所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 7.0和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，以α=0.05作為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 BPA暴露對小鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響

不同劑量BPA暴露對小鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響見圖1。在不同劑量[1、10、1 000 μg/(kg· d)]BPA處理的小鼠模型中，小鼠肝臟質(zhì)量顯著增加(P均＜0.01)。檢測肝組織TG含量發(fā)現(xiàn)，10 μg/(kg·d)BPA組小鼠肝臟TG水平明顯升高(P均＜0.01)。形態(tài)學實驗結(jié)果可見，在10 μg/(kg·d)BPA組小鼠肝臟HE染色結(jié)果中觀察到的空泡樣結(jié)構(gòu)最為明顯。肝組織油紅O染色結(jié)果可見，4個劑量組的小鼠肝臟均存在不同程度的脂質(zhì)積累，但10 μg/(kg·d)BPA組脂質(zhì)積累的程度最高，范圍最廣。結(jié)果顯示，不同劑量的BPA暴露未表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，使用10 μg/(kg·d)的暴露劑量時產(chǎn)生的損傷效應(yīng)最強，因此在后續(xù)實驗中我們選擇該劑量進行進一步研究。

圖1 不同劑量BPA暴露對小鼠肝臟脂質(zhì)積累程度的影響

2.2 BPA暴露對小鼠糖脂代謝的影響

BPA暴露對小鼠脂代謝的影響如圖2所示，BPA暴露提高了雄性小鼠肝臟TG水平。與單純HFD飼養(yǎng)組相比，BPA+HFD組的肝臟TG水平明顯升高，并且其肝臟脂質(zhì)積累明顯增加，脂滴形成的數(shù)量明顯增多。BPA暴露對小鼠葡萄糖代謝的影響如圖3所示，測量葡萄糖代謝相關(guān)指標，BPA暴露小鼠空腹血糖水平顯著升高。由IPGTT與IPITT實驗結(jié)果可知，與對照組相比，BPA暴露的小鼠糖耐量降低，并產(chǎn)生胰島素抵抗現(xiàn)象，曲線下面積明顯增大。BPA+HFD組明顯加重了HFD誘導的糖耐量異常及胰島素抵抗現(xiàn)象。糖原含量檢測結(jié)果顯示，BPA暴露的小鼠肝臟中的糖原含量顯著增加。

圖2 BPA單獨暴露或聯(lián)合HFD對小鼠肝臟脂質(zhì)積累的影響

2.3 BPA暴露對L02細胞的糖脂代謝影響

不同劑量BPA暴露對L02細胞脂質(zhì)積累程度的影響如圖4所示。體外實驗表明，在L02細胞中，隨著BPA處理濃度的增加，脂肪酸積累程度增加。脂肪酸吸收程度、油紅O染色強度及糖原含量測定顯示，細胞內(nèi)脂質(zhì)含量和糖原含量均有所增加，而胰島素刺激的葡萄糖吸收程度顯著降低。10 μmol/L BPA表現(xiàn)出更為顯著的效果，因此在體外實驗中選擇了該劑量進行后續(xù)驗證。BPA暴露對L02細胞糖脂代謝的影響如圖5所示。BPA暴露增強了L02細胞脂肪酸吸收能力，并提高了PA誘導的脂肪酸吸收程度。BPA顯著增加了PA誘導的脂質(zhì)蓄積。糖原含量檢測結(jié)果表明，BPA暴露使L02細胞中糖原含量顯著增加。

2.4 BPA暴露影響體內(nèi)及體外肝細胞糖脂代謝關(guān)鍵調(diào)控因子的表達

圖3 BPA單獨暴露或聯(lián)合HFD對小鼠糖代謝相關(guān)指標的影響

圖4 不同劑量BPA暴露對小鼠肝臟脂質(zhì)積累程度的影響

圖6的結(jié)果表明，BPA可以導致肝組織及體外肝細胞中一系列脂肪生成調(diào)控因子的表達水平發(fā)生改變。BPA暴露顯著升高了固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element binding protein 1，SREBP1)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)和硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-coenzyme A desaturase 1，SCD-1)的mRNA表達水平，并且降低了乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase 1，ACC-1)和 PPARα的mRNA表達水平。在BPA暴露的L02細胞中SREBP1、FASN、ACC-1和SCD-1 mRNA表達水平同樣升高。與對照組相比，BPA在體內(nèi)和體外可使PPARγ mRNA表達水平明顯上升。BPA+HFD組的小鼠肝臟和BPA+PA處理的L02肝細胞中，PPARγ mRNA表達與單純HFD飼養(yǎng)的小鼠或單純PA處理的L02細胞相比顯著上調(diào)。

圖5 BPA單獨暴露或聯(lián)合PA對L02肝細胞脂質(zhì)積累及糖代謝相關(guān)指標的影響

圖6 BPA體內(nèi)及體外暴露對一系列脂肪生成調(diào)控因子mRNA表達水平的影響

2.5 PPARγ參與BPA誘導的體內(nèi)及體外糖脂代謝紊亂

圖7 BPA聯(lián)合Rh1對小鼠肝臟脂質(zhì)積累及糖代謝相關(guān)指標的影響

為了驗證PPARγ是否在BPA誘導的肝臟代謝功能障礙中起關(guān)鍵作用，我們使用BPA聯(lián)合Rh1對小鼠肝臟脂質(zhì)積累及糖代謝相關(guān)指標進行檢測，結(jié)果見圖7。PCR結(jié)果顯示，Rh1明顯抑制了BPA誘導的PPARγ表達的增加。與BPA暴露組相比，Rh1處理的BPA暴露小鼠TG含量明顯降低。BPA+Rh1處理可顯著減少BPA誘導的肝脂質(zhì)滴合成，明顯改善脂質(zhì)蓄積。糖原含量測定結(jié)果顯示，Rh1可以明顯降低BPA暴露小鼠肝臟中的糖原含量。

在體外培養(yǎng)的L02肝細胞中，使用BPA聯(lián)合Rh1進行處理，對L02細胞的脂質(zhì)積累及糖代謝相關(guān)指標進行檢測，結(jié)果見圖8。與BPA暴露組相比，BPA+Rh1組中PPARγ表達水平明顯降低。Rh1能夠降低BPA暴露誘導的脂肪酸吸收程度，明顯改善脂質(zhì)積累情況。L02細胞中糖原含量有所降低，胰島素刺激的葡萄糖吸收程度明顯緩解。

3 討論

目前，BPA是一種無處不在的合成化學品，多項研究表明，持續(xù)接觸BPA可能與多種疾病密切相關(guān)，包括性功能障礙、代謝紊亂、心血管疾病和肥胖[15，23，25-31]等。大量證據(jù)顯示，人們?nèi)粘V泛使用的許多由高分子聚合物制作的產(chǎn)品中，都存在著BPA浸出的現(xiàn)象，以至于其可以通過飲食飲水的方式在不經(jīng)意間暴露，從而危害人體健康。除了消化道攝入之外，皮膚接觸購物小票和機票等熱敏紙材料是人體接觸BPA的另一個重要來源，研究表明手持其5 s即可將BPA高效的轉(zhuǎn)移到皮膚上[32-33]。

在本研究中，我們首先建立了不同劑量BPA處理的小鼠暴露模型，觀察并檢測其肝臟中脂質(zhì)積累情況，以判斷是否發(fā)生了脂代謝異常的現(xiàn)象。在4個不同濃度BPA處理的小鼠模型中，均存在肝臟脂質(zhì)積累增加的趨勢，但10 μg/(kg·d)暴露劑量導致的損傷程度顯著高于另外3組[1、100、1 000 μg/(kg · d)]。利用小鼠體內(nèi)暴露模型以及L02肝細胞的體外實驗研究BPA暴露是否與糖脂代謝紊亂相關(guān)，并進一步探索其可能的相關(guān)機制。

我們發(fā)現(xiàn)BPA暴露的小鼠肝臟和L02細胞中產(chǎn)生了脂代謝紊亂的現(xiàn)象，由于脂代謝異常在葡萄糖代謝功能障礙中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用，我們繼續(xù)研究BPA暴露對小鼠及細胞葡萄糖代謝的影響，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)及體外同樣存在嚴重的糖代謝紊亂現(xiàn)象。同時，我們重點關(guān)注了BPA聯(lián)合HFD對肝臟糖脂代謝的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠肝組織中，BPA聯(lián)合HFD均可以顯著誘導肝臟TG水平升高，脂質(zhì)積累增加，并且BPA聯(lián)合HFD對肝臟糖代謝異常及產(chǎn)生胰島素抵抗的作用顯著增強，提示BPA能夠加重HFD誘導的糖脂代謝紊亂。

圖8 BPA聯(lián)合Rh1對L02肝細胞脂質(zhì)積累及糖代謝相關(guān)指標的影響

由于BPA在體內(nèi)及體外暴露均顯示出了明顯的脂質(zhì)積累和葡萄糖代謝異常，因此我們測定了一系列與脂質(zhì)代謝調(diào)控相關(guān)基因的mRNA表達，以探討導致差異產(chǎn)生的可能原因。我們發(fā)現(xiàn)肝臟脂質(zhì)代謝異常和相關(guān)血糖異常發(fā)生的潛在機制可能與脂肪酸從頭合成、甘油三酯合成與脂肪形成等過程的激活有關(guān)，并伴隨脂肪酸氧化的減少。這些數(shù)據(jù)表明脂肪酸從頭合成和甘油三酸酯合成的激活可能是BPA暴露誘導的脂質(zhì)代謝異常的重要機制。與其他研究相比[4，34-35]，我們的研究選擇了更低的劑量來全面驗證了BPA暴露是否會對小鼠肝臟糖脂代謝產(chǎn)生類似的影響。

PPARγ是脂質(zhì)吸收與合成的關(guān)鍵調(diào)控因子[36]，在BPA暴露的小鼠肝臟和L02肝細胞中，其mRNA表達水平顯著升高，并且加重了HFD誘導的PPARγ表達量增加。人參皂苷Rh1是一種PPARγ的抑制劑[37-38]，使用Rh1抑制PPARγ的表達，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)積累程度明顯減輕。結(jié)果顯示，PPARγ的上調(diào)與體內(nèi)或體外BPA暴露引起的肝臟脂質(zhì)積累和葡萄糖代謝功能障礙有關(guān)，抑制其表達水平可以在一定程度上改善BPA導致的糖脂代謝紊亂發(fā)生，說明其可能是潛在的參與BPA誘導糖脂代謝紊亂的關(guān)鍵分子。

本研究仍存在一定的局限性，在后續(xù)研究中還需要解決以下問題：①我們分別使用0、1、10、100、1 000 μg/(kg·d)的BPA進行暴露，但結(jié)果缺乏劑量-效應(yīng)關(guān)系，高劑量BPA暴露的變化并不顯著。為何表現(xiàn)出了明顯的低劑量效應(yīng)仍有待研究。②我們僅選擇了變化最顯著的劑量10 μg/(kg·d)進行研究，但1 μg/(kg·d)的BPA同樣引起了小鼠的糖脂代謝紊亂。觀察更低劑量BPA暴露是否對機體產(chǎn)生不良影響具有更大的實際意義。

綜上所述，本研究明確了10 μg/(kg·d)的BPA暴露在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生顯著的肝臟脂質(zhì)積累和葡萄糖代謝紊亂，并且BPA和HFD在糖脂代謝紊亂中存在協(xié)同作用。BPA通過調(diào)控一系列脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，在體內(nèi)及體外產(chǎn)生明顯的脂質(zhì)積累，從而引起糖脂代謝紊亂現(xiàn)象的發(fā)生。抑制PPARγ的表達水平可顯著改善由BPA暴露導致的脂質(zhì)合成增加以及葡萄糖代謝異常，說明PPARγ可能在BPA誘導的糖脂代謝紊亂中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究為BPA暴露的劑量參考限值以及BPA誘導的糖脂代謝紊亂的病理機制提供了新的見解，并對后續(xù)進一步的深入研究提供了新的思路。