己二酸二(2-乙基己基)酯灌胃染毒對大鼠的一般生殖毒性研究

石 瑩，王 超，王 翀，顧 雯，張宏偉，段 鏈*

(中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021)

己二酸二(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)adipate，DEHA]是一種己二酸酯類的增塑劑，具有一定的光、熱穩(wěn)定性和耐水性，為聚氯乙烯的一種優(yōu)良耐寒增塑劑，常用于耐寒農(nóng)用薄膜、電纜包覆層、人造革、戶外用水管和冷凍食品的包裝薄膜。DEHA與聚烯烴類塑料分子之間由氫鍵或范德華力連接，隨時間的推移以及受溫度的影響可從塑料中遷移出來，從而對外界環(huán)境造成污染[1-2]。單曉梅等[3]于2011—2012年對巢湖西半湖水以及合肥市兩個水廠的水源水和出廠水進行增塑劑的調(diào)查和評估，發(fā)現(xiàn)巢湖水中DEHA的總體污染濃度較高，合肥市水源和出廠水中均檢出DEHA，污染程度與水源周邊工業(yè)廢水和生活污水排放污染狀況相符。陳麗等[4]于2008年對上海市以黃浦江為水源的管網(wǎng)水中微量有機物的污染狀況進行調(diào)查也檢出了含量較高的DEHA。除水體環(huán)境外，DEHA也廣泛存在于大氣、土壤和食品中，由于DEHA用于聚氯乙烯薄膜，因此食品也是人體暴露DEHA的主要來源。因其具有親脂性、難以降解等特點，并且可以通過食物鏈逐漸傳遞并富集，最后以較高的濃度進入人體或其他動物體內(nèi)。

我國已將DEHA列入優(yōu)先控制污染物名單，其對環(huán)境和健康的影響不容忽視。本研究以DEHA為研究目標(biāo)，參閱國內(nèi)外權(quán)威機構(gòu)關(guān)于DEHA的健康效應(yīng)資料，結(jié)合美國環(huán)境保護署關(guān)于DEHA的健康參考值指定方法和經(jīng)合組織化學(xué)品測試準(zhǔn)則415“一代生殖毒性實驗”，研究DEHA對親代大鼠的一般毒性作用、交配行為和對胎仔生長發(fā)育的影響，為確定DEHA短期暴露健康敏感效應(yīng)指標(biāo)和建立短期暴露健康參考值積累動物實驗資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇成年無生育史SD大鼠，清潔級，雄性動物為6～9周齡，雌性動物為9周齡，由北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供，動物許可證號SCXK(京)2015-0005。

1.2 儀器與試劑

DEHA購于國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司，分析純。以玉米油為溶劑。采用日立7180型生化分析儀檢測總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、 球 蛋 白 (globulin， GLO)、 總 膽 固 醇 (total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、堿性磷酸 酶 (alkaline phosphatase， ALP)、 肌 酐 (creatinine，CREA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、血尿素(UREA)。大鼠血清生化檢測試劑盒購于中生北控生物科技股份有限公司。

1.3 方法[5-7]

1.3.1 實驗動物分組和染毒方法120只SD大鼠飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所SPF級動物實驗室，室溫22～24℃，12 h/12 h明暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機分為低、中、高3個劑量[分別為28、170、1 080 mg/(kg·d)]DEHA染毒組和對照組，每組30只動物，雌雄比例為2∶1。染毒組大鼠采用灌胃方式給予受試物，每天灌胃1次，持續(xù)灌胃整個實驗周期，各組雄鼠結(jié)束染毒后，雌鼠在交配期、妊娠期持續(xù)染毒至實驗結(jié)束，每周測量1次體質(zhì)量調(diào)整灌胃量；對照組大鼠自由攝食飲水。

雄鼠染毒10周、雌鼠染毒2周后同組動物合籠，合籠雌雄比例為2∶1，合籠期間每天早晨檢查陰栓，見陰栓日規(guī)定為受孕第0天，合籠時間最長為21 d。合籠結(jié)束處死雄鼠和未交配成功雌鼠，交配成功雌鼠受孕第19天時處死。

1.3.2 檢測指標(biāo)及方法實驗期間，每天觀察并記錄大鼠的一般狀況及攝食、飲水和死亡情況。定期測量動物體質(zhì)量，記錄交配成功的動物數(shù)、交配成功天數(shù)、懷孕動物數(shù)、每窩胎仔數(shù)和胎仔體質(zhì)量。

采用腹主動脈采血分離血清，檢測血清中TP、ALB、 GLO、 TC、 TG、 ALP、 CREA、 ALT、 AST、UREA。采血后解剖取肝、腎、卵巢、睪丸、附睪分別稱取質(zhì)量，計算臟器系數(shù)(臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)并固定于中性甲醛溶液中，進行組織病理學(xué)檢查。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊性時用SNK方法分析，方差不齊時用Dunnett方法分析。

2 結(jié)果

2.1 DEHA染毒對親代大鼠體質(zhì)量、臟器質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響

DEHA染毒對親代大鼠體質(zhì)量、臟器質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響見表1和表2。由表1可見，與對照組比較，高劑量組親代雄性大鼠終體質(zhì)量降低(P＜0.01)、睪丸臟器系數(shù)升高(P＜0.05)。表2顯示，與對照組比較，高劑量組親代雌性大鼠肝、腎質(zhì)量及肝、腎臟器系數(shù)均升高(P＜0.01或P＜0.05)，其余指標(biāo)未出現(xiàn)明顯變化。

表1 DEHA染毒對親代雄性大鼠體質(zhì)量、臟器質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響（n=10）

表2 DEHA染毒親代雌性大鼠體質(zhì)量、臟器質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響（n=20）

2.2 DEHA染毒對親代大鼠血清中肝、腎和代謝相關(guān)生化指標(biāo)的影響

DEHA染毒對親代大鼠血清中肝、腎和代謝相關(guān)生化指標(biāo)的影響見表3和表4。表3顯示，高劑量組親代雄性大鼠AST水平、CREA水平與對照組比較均升高(P＜0.05)；低、中劑量組與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。表4顯示，低劑量組親代雌性大鼠AST水平與對照組比較降低(P＜0.05)；高、中劑量組與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。高劑量組親代雌性大鼠GLO、TC水平與對照組比較均升高(P＜0.05)；低、中劑量組與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。其余指標(biāo)未出現(xiàn)明顯變化。

表3 DEHA染毒對親代雄性大鼠血清中肝、腎和代謝相關(guān)生化指標(biāo)的影響（n=10）

表4 DEHA染毒對親代雌性大鼠血清中肝、腎和代謝相關(guān)生化指標(biāo)的影響（n=20）

2.3 DEHA染毒對親代大鼠交配行為及胎仔體質(zhì)量的影響

見表5。與對照組相比較，高劑量組的胎仔體質(zhì)量降低(P＜0.01)；低、中劑量組與對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。DEHA染毒對親代大鼠交配行為無明顯影響。

2.4 大鼠肝、腎、睪丸和卵巢組織病理學(xué)檢查結(jié)果

各DEHA染毒組動物肝臟組織結(jié)構(gòu)及肝細胞分化未見異常，匯管區(qū)未見小膽管及結(jié)締組織增生。各DEHA染毒組中動物的肝臟中出現(xiàn)極少量的小空泡，見圖1A，以及肝臟小葉或者肝臟靜脈周圍有極少量的灶性壞死炎性細胞浸潤，見圖1B。

各DEHA染毒組動物腎臟被膜完整，皮、髓質(zhì)邊界清楚，腎小球均勻分布于皮質(zhì)區(qū)，結(jié)構(gòu)正常；各DEHA染毒組均觀察到腎臟腎小管或集合管間隙出現(xiàn)極少量的炎性細胞浸潤，見圖1C。

各DEHA染毒組雄性動物睪丸生精上皮發(fā)育良好，并有成熟精子形成，支持細胞、間質(zhì)細胞未見增生，見圖1D。附睪管、輸出小管結(jié)構(gòu)未見異常，管腔內(nèi)均可見大量成熟精子，見圖1E。

各DEHA染毒組雌性動物卵巢內(nèi)可見各發(fā)育階段卵泡及黃體，無出血、囊腫、纖維化病變。均觀察到黃體增大(1級)，見圖1F。

表5 DEHA染毒對親代大鼠交配行為及胎仔體質(zhì)量的影響

圖1 DEHA染毒大鼠組織病理切片典型示例圖(HE染色，×10)

3 討論

DEHA作為聚氯乙烯的一種優(yōu)良耐寒增塑劑，廣泛應(yīng)用于建筑材料、食品包裝袋、兒童玩具、醫(yī)療器械，隨著降解、遷移已經(jīng)成為我國水環(huán)境中廣泛存在的有機污染物。飲用水污染和食品污染成為DEHA進入人體的主要途徑，所引起的健康風(fēng)險越來越受到關(guān)注。本試驗參考OECD 415一代生殖毒性研究的方法選用SPF級SD大鼠，從親代大鼠的一般癥狀、血清學(xué)指標(biāo)和臟器病理檢查以及胎仔的數(shù)量和體質(zhì)量等方面對DEHA灌胃染毒引起的大鼠一般生殖毒性效應(yīng)進行評估。

Arrington等[8]發(fā)現(xiàn)給大鼠飼喂含有DEHA的食物一個月，在2.5 g/kg劑量水平上會阻礙其生長；Smyth等[9]研究表明，給Sherman大鼠飼喂含DEHA的食物90 d，在2.92 g/kg劑量水平發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)生長受限，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)肝、腎中出現(xiàn)損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組[1 080 mg/(kg·d)]經(jīng)口灌胃給予DEHA，大鼠終體質(zhì)量與對照組比較降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。終體質(zhì)量降低能從一定程度上反映DEHA灌胃染毒引起大鼠生長受限，可能是因為DEHA染毒引起大鼠食欲不振。與以往文獻報道相比，引起體質(zhì)量增長受限的劑量水平低，可能是因為本實驗采用灌胃染毒可以準(zhǔn)確控制藥量，減少飼喂染毒造成受試物損失。高劑量組[1 080 mg/(kg·d)]經(jīng)口攝入DEHA，雌性大鼠肝、腎臟器系數(shù)和雄性大鼠睪丸臟器系數(shù)升高，可能是因為DEHA引起過氧化物酶體增殖導(dǎo)致肝、腎組織增生質(zhì)量增加[10]。AST、TC、GLO和CREA血生化指標(biāo)水平異常也從另一個角度證明經(jīng)口攝入DEHA對大鼠肝腎有影響。病理鏡檢各實驗組均發(fā)現(xiàn)肝臟中出現(xiàn)極少量的小空泡以及肝臟小葉或者肝臟靜脈周圍有極少量的灶性壞死炎性細胞浸潤、腎小管或集合管間隙出現(xiàn)極少量的炎性細胞浸潤和黃體增大(1級)，但是各劑量組與對照組并無明顯區(qū)別。

Dalgaard等[11]發(fā)現(xiàn)DEHA可造成出生Wistar仔鼠體質(zhì)量明顯下降，本研究發(fā)現(xiàn)高劑量組[1 080 mg/(kg·d)]胎仔體質(zhì)量降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可能是因為DEHA對母體有輕度影響從而造成對胎仔也有輕微影響。除此之外并未發(fā)現(xiàn)DEHA對大鼠的生殖能力造成影響，與以往文獻報道結(jié)果一致。

綜上所述，高劑量組DEHA灌胃染毒會引起大鼠生長受限，肝、腎和睪丸增生，AST、TC、GLO和CREA血生化指標(biāo)水平異常，胎仔體質(zhì)量降低。表明灌胃染毒DEHA對大鼠有輕微的毒性，主要作用于肝、腎等組織，同時因為對母體的影響造成對胎體發(fā)育有一定影響。本研究針對DEHA暴露對親代大鼠的一般毒性、交配行為和對胎仔生長發(fā)育的影響進行了初步研究，為DEHA健康風(fēng)險評估提供實驗室依據(jù)。