汕頭市婦女HPV-52感染與宮頸鱗狀上皮病變的關系

王媛媛，陳依超，鄭 潔，彭燕燕，王少洪

(1．汕頭市中心醫院病理科，廣東 汕頭515041；2．汕頭市中心醫院臨床醫學研究中心，廣東 汕頭 515041；3．汕頭市中心醫院檢驗科，廣東 汕頭 515041)

據2018年全球癌癥數據統計顯示，子宮頸癌發病率占惡性腫瘤發病率的6.6%，死亡率居第4位[1]。根據我國國家癌癥中心發布的2015年全國癌癥數據統計結果顯示：惡性腫瘤中子宮頸癌新發病例數居第6位，占比6.04%，死亡率居第8位，占比3.61%[2]。眾所周知，持續性的人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是子宮頸癌發生的首要和必要條件，HPV檢測及宮頸薄層液基細胞學篩查(thinlayer liquid-based cytology test，LCT)有助于發現早期病變[3-4]。本課題前期研究發現：在汕頭市宮頸病變篩查人群中，單一感染及多重感染最常見的亞型是HPV-52[5]，但HPV-52感染在該地區的致病特點，目前尚未見文獻報道。本研究立足于汕頭市人群，分析HPV-52感染在宮頸鱗狀上皮病變中的發病風險，擬為研制針對這一特定人群HPV感染疫苗提供理論依據，并為該市HPV-52感染人群提供診斷、治療及預防的參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析汕頭市中心醫院2015年1月1日—2018年7月31日期間門診、體檢及住院患者同時進行HPV檢查及LCT檢查者37 700例作為研究對象。研究對象中去除LCT檢查不滿意標本，同時排除有宮頸鱗狀細胞和腺細胞異常4例及188例腺細胞異常標本，只針對子宮頸鱗狀細胞學異常進行相關統計?；颊邽樯穷^本市人群，按照美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南，對其中3 924例進行了宮頸活檢。本研究經過汕頭市中心醫院倫理委員會批準。

1.2 宮頸HPV及LCT檢查

患者同時行宮頸HPV檢測及LCT檢查?；颊哂诜窃陆浧谌?，取樣前3 d禁性生活，無陰道用藥，無盆浴，充分暴露宮頸，無菌棉球拭凈陰道及宮頸口分泌物，取材采用JUNO一次性使用宮頸細胞采樣刷(北京世紀眾諾醫療器材有限公司)，將刷毛緊貼宮頸口，毛刷基底面沿宮頸外口順指針旋轉5圈，取出采樣刷放入SafePath婦科細胞保存液(北京世紀眾諾醫療器材有限公司)。推動取樣刷桿的套裝，使刷頭落入保存液中，樣本貼條形碼。

HPV分型檢測采用醫用核酸分子快速雜交基因分型試劑盒(購自廣東凱普生物科技股份有限公司)，包含15種高危HPV，即HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-5l、-52、-53、-56、-58、-59、-66和-68；6種低危型HPV DNA，即HPV-6、-11、-42、-43、-44、CP8304。HPV標本放入裝有細胞保存液的樣本管中，振蕩器上振蕩20 s，加入SafePath樣本密度分離液，1 080 r/min，離心2 min 15 s，再吸取樣本0.5 mL至離心管中，14 000 r/min離心1 min，棄上清，加入400 μL溶液Ⅰ，振蕩，在沸水或者干浴鍋上加熱15 min。再加入400 μL溶液Ⅱ，蓋上蓋子，振蕩數秒，使溶液Ⅱ充分混勻；室溫下放置2 min，14 000 r/min離心5 min，去上清。14 000 r/min離心1 min，把剩余的殘液吸干凈，然后在室溫下自然晾干3～5 min后，加入60 μL的溶液Ⅲ溶解DNA，在振蕩器上振蕩10 s左右。取上清液進行PCR反應。采用上海生工公司合成的HPV通用PCR引物MY(5′-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3′，5′-GCMC AGGZGWCATAAYAATGG-3′，其中 R=A+G，W=A+T，Y=C+T，產物長度為452 bp)。PCR擴增體系為PCR混合液23.25 μL，DNA聚合酶0.75 μL，1 μL模板構成，通過博日PCR擴增儀進行。反向點雜交(HHM-2型醫用核酸分子快速雜交儀)檢測擴增產物與包被有型特異性探針膜雜交結果，采用堿性磷酸酶系統定性檢測從而對21種HPV基因型進行分型檢測。擴增時將反應管放入PCR擴增儀，按照凱普生物化學有限公司的人乳頭狀瘤病毒分型檢測試劑盒(PCR+膜雜交法)說明書進行擴增。20℃、10 min；95℃、9 min；95 ℃、20 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72℃、5 min，4℃ HOLD進行擴增，40個循環。雜交結果陽性判讀為雜交條膜上的Biotin對照顯色，同時HPV雜交點也顯色。檢測結果陽性點為清晰可見的藍紫色圓點。如果有一個或一個以上HPV分型點為陽性表示該類型HPV檢測陽性。結果可為單一或混合HPV感染。

LCT采樣同上，離心棄上清液后常溫下用PsP50518制片染色一體機(TRiPath公司，美國)制片。細胞學檢查結果由兩位病理醫師按照伯塞斯達系統(the Bethesda system，TBS)分級標準(2014版)分為：未見上皮內病變或惡性病變(negativefor intraepithelial lesion or malignancy，NILM)36 442例(96.66%，36 442/37 700)、非典型鱗狀細胞，意義不明確(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)714例(1.89%，714/37 700)、低級別鱗狀上皮內病變(low-gradesquamousintraepitheliallesion，LSIL)147例(0.39%，147/37 700)、非典型鱗狀細胞，不排除高級別鱗狀上皮內病變(atypical squamous cells cannot exclude HSIL，ASC-H)151例(0.40%，151/37 700)、高級別鱗狀上皮內病變(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)201例(0.53%，201/37 700)和鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)45例(0.12%，45/37 700)。

1.3 組織病理學檢查

共3 924位患者進行了子宮頸活檢，病理診斷按照婦科腫瘤病理診斷標準進行分類，由2位婦科腫瘤專業的病理醫師進行閱片。其中診斷為慢性炎癥者1 882例、宮頸LSIL者1 326例、宮頸HSIL者510例、SCC者203例、陰道鱗癌1例、鱗癌合并腺癌2例。以病理活檢結果作為診斷金標準，其中陰道鱗癌1例及鱗癌合并腺癌2例不納入本次統計，本文只統計發生在宮頸部位的單一的鱗狀細胞病變。

1.4 統計學處理

使用SPSS 19.0軟件建立數據庫，計數資料率的比較采用頻數分布進行統計，構成比和率的比較采用卡方檢驗，以α=0.05為檢驗水準。風險評估采用卡方檢驗2×2列表。

2 結果

2.1 HPV-52感染亞型頻數分布及宮頸細胞學ASCUS及以上患者中常見型別

在37 700位患者中HPV-52的感染率為3.55%(1 338/37 700)，其中HPV-52單一感染率為65.92%(882/1 338)，HPV-52多重(指兩種及以上HPV亞型)感染率為34.08%(456/1 338)。HPV-52多重感染456例中包含兩重感染313例，三重及以上感染143例，兩重感染中排在前3位的亞型依次是HPV-58/52(12.46%，39/313)、HPV-53/52(11.18%，35/313)和 HPV-16/52(11.18%，35/313)，見圖1和圖2。HPV-52多重感染者LCT篩查出ASC-US及以上病變患者中，最多見HPV-16/52型，宮頸細胞學HSIL患者中最多見HPV-16/52型。

圖1 HPV-52兩重感染頻數分布

圖2 HPV-52兩重感染細胞學篩查異常分布

2.2 宮頸組織活檢中HPV-52感染特點及風險

宮頸組織活檢結果發現：與HPV-52單一感染比較，HPV-52/16多重感染患HSIL或者SCC風險增加(P＜0.01，OR=8.27)，并且增加從HSIL發展為SCC的風險(P=0.01，OR=12.65)，而包含HPV-52但不包含HPV-16的多重感染與HPV-52單一感染比較，患HSIL/SCC風險(P=0.51)和從HSIL發展為SCC的風險(P=0.41)均未明顯增加。與包含HPV-52但不包含HPV-16多重感染比較，HPV-52/16多重感染患HSIL/SCC的風險(P＜0.01，OR=3.36)和從HSIL發展到SCC的風險(P=0.03，OR=1.29)均顯著增加。與HPV-52單一感染比較，HPV-16單一感染患HSIL/SCC的風險(P＜0.01，OR=6.93)和從HSIL發展到SCC的風險(P＜0.01，OR=41.86)均顯著增加，見表1及表2。

表1 HPV-52多重感染發生HSIL/SCC風險分析

3 討論

HPV是球形DNA病毒，具有嗜上皮性，基因型眾多，其中40種可以感染女性生殖道，并且存在地域性及種族差異。中國整體人群感染前5位的亞型分別為16、52、58、53和18[6-7]。HPV-52、-58、-16是韓國和我國華南地區宮頸上皮內病變最常見的感染亞型[8-9]。汕頭市與廈門、漳州同屬于東南沿海，地理位置鄰近，具有相同的感染亞型HPV-58、-16、-18[10-11]。同時汕頭又具有本市人群中特有的最常見感染亞型HPV-52。本研究發現HPV-52多重感染常見的亞型分別是HPV-58/52(12.46%，39/313)、HPV-53/52(11.18%，35/313)、HPV-16/52(11.18%，35/313)。從細胞學篩查結果中發現，含有HPV-52的多重感染中，細胞學異?；颊?，尤其是HSIL患者中最多見的是HPV-16/52感染。宮頸活檢結果進一步證實，只要含有HPV-16亞型的感染，無論是與HPV-16單一感染還是包含HPV-52的多重感染，與HPV-52單一感染比較，均增加患HSIL或者SCC風險(P均＜0.01)，并且增加HSIL癌變風險(P均＜0.01)。Bruni等[12]Meta分析顯示 HPV-16、HPV-18是全世界最常見的HPV致癌亞型。本研究結果與上述研究結果一致，本地區HPV感染致癌亞型主要是HPV-16。HPV-52單一感染活檢結果為慢性炎癥或者低度鱗狀上皮內病變者248例，診斷為高度鱗狀上皮內病變者43例，只有1例診斷為鱗狀細胞癌。HPV-52多重感染不含HPV-16的患者活檢中為慢性炎癥或者鱗狀上皮內低度病變者135例，診斷為鱗狀上皮內高度病變者29例，無宮頸鱗狀細胞癌患者。本研究結果表明無論HPV-52的單一感染與合并不包含HPV-16的多重感染比較主要發生慢性炎癥或者LSIL、HSIL病變，并且不增加患HSIL或者SCC風險，也不增加癌變風險。So等[13]的研究結果中也證實HPV-52引起宮頸上皮內瘤變(CINII及CINI)。

總之，本研究發現HPV-52是汕頭市HPV感染最常見亞型，該亞型主要引起宮頸LSIL或者HSIL病變，當HPV-52合并HPV-16感染時癌變風險增加，應重視HPV-52合并HPV-16患者的癌變風險防控。