利用全胚胎和微團培養(yǎng)模型評價硝酸鑭的發(fā)育毒性

康陳萍，劉青云，肖倩倩，郝衛(wèi)東*

(北京大學公共衛(wèi)生學院毒理學系/食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191)

元素周期表第Ⅲ族的15種過渡金屬元素被稱為鑭系元素，分別為鑭(La)及鑭系物。鑭系物由14種元素組成，鑭系元素以及與其化學和物理學特性非常相似的第Ⅲ族的過渡金屬元素鈧(Sc)和釔(Y)共同組成稀土元素。

硝酸鑭[lanthanum nitrate，La(NO3)3]是鑭系化合物的一種，可用于蓄電池生產(chǎn)、流動催化裂解、廢氣及廢水凈化系統(tǒng)等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[1]，也被用于農(nóng)用稀土肥料等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[2]。茶葉生產(chǎn)常用添加稀土元素的葉面肥產(chǎn)品(催芽劑)，即硝酸稀土植物生長調(diào)節(jié)劑。人為將含稀土元素的葉面肥直接噴灑于茶樹的舉措是導致茶葉稀土元素高殘留(超標)的主要原因[2]。研究表明，我國鄂東南地區(qū)磚茶中稀土含量分布為4.09～8.01 mg/kg，其中 5 種輕稀土元素(Sc、Y、La、Ce和Nd)之和占稀土總量的82.6%，其含量已超過《GB 2762-2005食品中污染物限量》中規(guī)定的茶葉中稀土(氧化物總量)限量值(2 mg/kg)。

朱為方等[3]根據(jù)動物實驗并結(jié)合人群流行病學調(diào)查結(jié)果提出稀土的每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)以氧化物計為4.41 mg/d(以元素計為0.03 mg/kg)。第四次中國總膳食研究[4]結(jié)果顯示，我國成年男子的16種稀土攝入量平均為250.9 μg/d(相當于4.18 μg/kg)，總體范圍為27.5～706.2 μg/d，其中鑭元素的攝入量平均為 29.1 μg/d(相當于 0.49 μg/kg)，總體范圍為1.6～112.2 μg/d，未超過目前提出的ADI值。

稀土元素的環(huán)境暴露對人體健康具有一定的影響。研究顯示，稀土礦區(qū)兒童頭發(fā)內(nèi)鑭元素的含量(0.14～6.93 μg/g)遠超文獻報道的平均水平(0.04～0.4 μg/g)[5]，其血液中稀土總量為2.18 ng/g(相當于2.29 ng/mL)，是對照區(qū)(1.26 ng/g，相當于1.32 ng/mL)的1.73倍，有顯著性差異，且其血液稀土負荷水平與其血壓及肺活量呈負相關(guān)[6]，表明稀土對兒童健康發(fā)育可能具有一定影響。

稀土可透過胎盤屏障，導致胎兒或新生兒發(fā)育遲緩。Zhang等[7]的研究表明，以0.83 μg/d的劑量給予孕鼠含釔和鐿的混合溶液9 d，可在新生小鼠體內(nèi)檢測到的稀土元素為母鼠接觸劑量總量的14.1%，提示稀土可快速經(jīng)胎盤吸收并轉(zhuǎn)運到胚胎。研究顯示，非礦區(qū)產(chǎn)婦靜脈血和臍血中鑭的含量分別為0.543和0.541 ng/g(相當于0.570和0.568 ng/mL)，二者之間無明顯差異，表明鑭可能透過胎盤屏障經(jīng)臍帶血進入胎兒體內(nèi)[8]。Xiao等[9]的研究表明，大鼠孕期經(jīng)口染毒硝酸鑭(2、20、60 mg/kg)，母鼠與出生后4 d仔鼠血液中的鑭元素含量具有劑量依賴性，且60 mg/kg染毒組出生后61～66 d仔鼠的空間記憶學習能力和血漿神經(jīng)遞質(zhì)水平均受到明顯的影響。

稀土對胚胎早期發(fā)育具有一定的毒性效應，可導致胚胎發(fā)育缺陷甚至畸形。有研究表明，稀土可導致海膽早期生命階段胚胎發(fā)育缺陷并具有明顯的劑量相關(guān)趨勢[10]。此外，親代暴露于稀土可導致其精子活性及受精成功率降低、子代發(fā)育缺陷率升高[11]。據(jù)報道，小鼠孕期經(jīng)腹腔注射給予氯化鑭可導致其受孕成功率及平均胎產(chǎn)仔數(shù)顯著降低，且其易感期為圍著床期(孕期第4～6天)及臨產(chǎn)期(孕期第14～16天)[12]。

我國為稀土生產(chǎn)儲存大國，但現(xiàn)有稀土元素的發(fā)育相關(guān)毒理學資料不夠完整。本研究參考歐洲替代方法驗證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)的大鼠植入后全胚胎培養(yǎng)(post-implantation whole embryo culture，WEC)[13]和微團培養(yǎng)(micromass test，MM)[14]體外預測模型，評價硝酸鑭潛在的胚胎發(fā)育毒性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及處理

SPF 級 SD 大鼠(雄性 280～300 g，雌性 220～240 g)，購自北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(合格證號11804700015381)。動物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，室溫20～25℃，濕度50%～60%，12 h/12 h明暗周期，自由飲水和攝食。動物適應性飼養(yǎng)5 d后將雌、雄SD大鼠于18:00按2∶1比例合籠，次日7:00進行陰道涂片檢查，鏡下可見精子視為受孕成功，并記為受孕第0天(GD0)。動物實驗方案經(jīng)北京大學生物醫(yī)學倫理委員會實驗動物福利倫理分會審查批準。

小鼠胚胎成纖維細胞BALB/c 3T3細胞系，由北京大學人類疾病基因研究中心贈送。

1.2 主要試劑與儀器

硝酸鑭(純度大于99.999%)及Ham's F-12培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Thermo公司Gibco系列，胎牛血清購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，胰蛋白酶(1∶250)購自美國BD公司，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、中性紅和阿利新藍購自美國Amresco公司，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)購自北京索萊寶科技有限公司，鹽酸胍購自美國Amresco公司，青鏈霉素購自美國Thermo公司Gibco系列。

體視顯微鏡為OLYMPUS公司SZX2-ILLT型，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱為Gold-SIM公司Hp11型雜交箱改造，細胞培養(yǎng)箱為Thermo公司3111型，酶標儀為德國Omega公司FLUOstar Omega型，顯微鏡成像設備為Motic公司2000型。

1.3 全胚胎培養(yǎng)模型

1.3.1 全胚胎培養(yǎng)過程 受孕9.5 d的SD大鼠，乙醚麻醉后處死，無菌條件下取出子宮，以37℃預溫的Hank's液清洗2次后轉(zhuǎn)移至新的盛有Hank's液的平皿中，剪開子宮并剝離蛻膜團，轉(zhuǎn)移到盛有Hank's液的平皿中，將胚胎從蛻膜團中剝離，在體視顯微鏡下剝除Reichert's膜，保留完整臟層卵黃囊，挑選含3～5個初始體節(jié)、外形飽滿的健康胚胎，隨機分組。將37℃預溫、含相應濃度受試物的即刻離心血清(100%大鼠血清、56℃滅活30 min、0.22 μm過濾、-20℃保存)加入50 mL培養(yǎng)瓶中，按每個胚胎1 mL血清、每瓶4個胚胎的比例加入相應數(shù)量胚胎后于37℃進行旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48 h。分別于開始培養(yǎng)前(O2、CO2、N2的體積分數(shù)分別為10%、5%、85%)、培養(yǎng)至第16小時(O2、CO2、N2的體積分數(shù)分別為20%、5%、75%)、第26小時(O2、CO2、N2的體積分數(shù)分別為40%、5%、55%)進行3次充氣，每次充氣時間2.5 min。

根據(jù)預實驗結(jié)果，100%胚胎產(chǎn)生發(fā)育畸形時的濃度作為最高染毒濃度，對胚胎無明顯效應的濃度作為最低濃度，硝酸鑭最終染毒濃度為0、0.12、0.23、0.46、1 mmol/L，每組至少7只胚胎。

1.3.2 BALB/c 3T3細胞增殖活性檢測 BALB/c 3T3細胞在高糖DMEM完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于37℃、CO2體積分數(shù)為5%、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱，至80%～90%匯合時按1∶4～1∶8比例傳代，2～3 d傳一代。

取BALB/c 3T3細胞懸液，臺盼藍染色計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為5×103個/mL，混勻后以每孔100 μL的量接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)2 h待細胞貼壁后每孔加入100 μL含2×終濃度受試物的完全培養(yǎng)液，對照組加入100 μL不含受試物的完全培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。第3天更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)第6天，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)2 h后小心棄去各孔液體，將DMSO以每孔150 μL的量加入96孔板中，振蕩搖勻10 min后于560 nm檢測吸光度值。

將全胚胎培養(yǎng)模型允許的最大濃度作為最高濃度，為防止高濃度間梯度過大，首次稀釋采用1.5倍梯度，而后以2倍梯度稀釋。硝酸鑭終濃度為0、0.03、 0.06、 0.12、 0.23、 0.46、 0.92、 1.85、 2.31 mmol/L，每個濃度設置6個復孔。實驗重復3次。

1.3.3 胚胎發(fā)育評分及毒性預測 胚胎培養(yǎng)48 h后，選取仍有心跳及血液循環(huán)的胚胎，測定其卵黃囊直徑(yolk sac diameter，YSD)、頂臀長(crown-rump length，CRL)、頭長(head length，HL)等生長指標。根據(jù)Brown's評分法，記錄其總形態(tài)學評分(total morphological score，TMS)、心跳、卵黃囊循環(huán)、尿囊循環(huán)、體節(jié)數(shù)(somite)、有無特殊畸形等。繪制劑量反應關(guān)系曲線，計算50%胚胎產(chǎn)生畸形時的濃度(IC50，mal)、對胚胎形態(tài)學評分(TMS)無影響的最大濃度(ICNOEC，TMS)、達到最大致畸率的最低濃度(ICmax)等數(shù)據(jù)資料，根據(jù)560 nm處吸光度值計算50%的BALB/c 3T3細胞增殖受抑制時的受試物濃度(IC50，3T3)。

利用全胚胎培養(yǎng)預測模型[13]對胚胎發(fā)育毒性進行評價。ECVAM的全胚胎培養(yǎng)預測模型分為預測模型1(prediction model 1，PM1)和預測模型2(prediction model 2，PM2)，各具有3個判別式(判別式中各參數(shù)單位均為μg/mL)。

PM1判別式如下：

判別式 I，18.08×lg(IC50，mal)-11.56×lg(ICNOEC，TMS)-10.19

判別式 II，21.55×lg(IC50，mal)-15.31×lg(ICNOEC，TMS)-10.65

判別式 III，8.70×lg(IC50，mal)-8.53×lg(ICNOEC，TMS)-2.53

PM2判別式如下：

判別式 I，0.21×[(IC50，3T3-ICNOEC，TMS)/IC50，3T3)]×100+15.37×lg(ICmax)-23.58

判別式II，0.27×[(IC50，3T3-ICNOEC，TMS)/IC50，3T3)]×100+17.71×lg(ICmax)-32.37

判別式 III，0.093×[(IC50，3T3-ICNOEC，TMS)/IC50，3T3)]×100+4.21×lg(ICmax)-4.23

若判別式I的值高于判別式II和判別式III，化學物判定為無發(fā)育毒性化學物；若判別式II的值高于判別式I和判別式III，化學物判定為弱發(fā)育毒性化學物；若判別式III的值高于判別式I和判別式II，化學物判定為強發(fā)育毒性化學物。

1.4 微團培養(yǎng)模型

1.4.1 微團培養(yǎng)過程受孕第13天的SD大鼠，乙醚麻醉后處死，無菌條件下分離子宮，PBS清洗兩次后轉(zhuǎn)移至盛有37℃預溫PBS的平皿中。剪開子宮暴露蛻膜團，并將其轉(zhuǎn)移到盛有新PBS的平皿中，將胚胎從蛻膜團中剝離，剝除Reichert's膜后挑選含40～45個體節(jié)的健康胚胎，分別取其肢芽轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。PBS清洗3遍后加入0.25%胰酶-0.53 mmol/L EDTA并置于37℃孵育消化10 min，Ham's F-12培養(yǎng)液終止消化并清洗3次后棄去清洗液，重懸為呈單細胞懸液，200目網(wǎng)篩過濾后臺盼藍計數(shù)，細胞存活率須在90%以上。調(diào)整細胞濃度為2×107個/mL，于96孔板每孔正中央點種5 μL細胞懸液，培養(yǎng)箱(37℃、CO2體積分數(shù)為5%)中孵育2～3 h，細胞貼壁后每孔補足200 μL含相應濃度受試物的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d。

以5-氟尿嘧啶作為陽性對照建立模型，染毒濃度分別為15.62、31.25、62.5、125、250、500和1 000 ng/mL。將微團培養(yǎng)模型允許的最大濃度作為最高濃度，為防止高濃度間梯度過大，首次稀釋采用1.5倍梯度，而后以2倍梯度稀釋。硝酸鑭終濃度為0.03、0.06、0.13、0.25、0.5、1、2及3 mmol/L，每個濃度設置6個復孔。實驗平行重復3次。

1.4.2 微團細胞增殖及分化檢測細胞培養(yǎng)第5天，去除培養(yǎng)液后加入0.005%的中性紅染液200 μL，37℃孵育3 h后棄中性紅，生理鹽水洗3次后加入200 μL甲醛鈣1 min，棄甲醛鈣加入200 μL酸性乙醇搖床提取60 min，并于540 nm測定吸光度值以檢測其細胞增殖能力。

生理鹽水清洗3次去除孔內(nèi)中性紅，加入1%阿利新藍常溫過夜。生理鹽水清洗3次后拍照并計數(shù)微團數(shù)目，6 mol/L鹽酸胍振蕩提取2 h后于620 nm測定吸光度值，以檢測肢芽細胞分化為軟骨細胞的能力。

1.4.3 發(fā)育毒性預測根據(jù)中性紅染色測定的吸光度值，計算50%細胞增殖活性被抑制時的濃度(50%inhibition of cell viability and growth，IC50)；根據(jù)阿利新藍染色的吸光度值計算50%細胞分化及集落形成受抑制的濃度(50%inhibition of cells differentiation，ID50)。

ECVAM的微團培養(yǎng)發(fā)育毒性預測模型[14]包括3個判別式，具體如下(判別公式中各參數(shù)單位均為μg/mL)：

判別式I，6.65×lg(ID50)-9.49

判別式II，6.16×lg(ID50)-8.29

判別式III，-1.31×lg(ID50)-1.42

若判別式I的值高于判別式II和判別式III，化學物判定為無發(fā)育毒性化學物；若判別式II的值高于判別式I和判別式III，化學物判定為弱發(fā)育毒性化學物；若判別式III的值高于判別式I和判別式II，化學物判定為強發(fā)育毒性化學物。

依據(jù)ECVAM關(guān)于微團培養(yǎng)的另一模型[15]，對發(fā)育毒性的特異性進行判別，若IC50和ID50的比值大于2，說明該物質(zhì)具有特異的潛在致畸性；若比值小于2，說明該物質(zhì)的發(fā)育毒性可能與其細胞毒性有關(guān)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

采用SPSS 26.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。當數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性時，采用單因素方差分析(one way ANOVA)并用LSD及Dunnett-t法進行兩兩比較。當不滿足正態(tài)分布或方差不齊時，采用Dunnett's C進行多重比較。全胚胎培養(yǎng)模型中的形態(tài)學評分和體節(jié)數(shù)采用Mann-Whitney U檢驗。采用Linear-by-Linear Association法進行劑量相關(guān)趨勢性檢驗。設定統(tǒng)計學檢驗水準α=0.05。各培養(yǎng)模型中的IC50及ID50用GraphPad Prism 7軟件進行擬合計算。

2 結(jié)果

2.1 硝酸鑭對胚胎生長的影響

0.23 mmol/L及以上濃度硝酸鑭染毒組胚胎卵黃囊直徑較對照組減小，且呈現(xiàn)出明顯的劑量相關(guān)趨勢，0.46和1 mmol/L組胚胎卵黃囊直徑、頂臀長、頭長均明顯減小(圖1)。提示較高濃度硝酸鑭可能會導致胚胎生長遲緩。

2.2 硝酸鑭對胚胎形態(tài)及各器官系統(tǒng)發(fā)育的影響

根據(jù)Brown's評分法對胚胎進行形態(tài)學評分，0、0.12、0.23、0.46、1 mmol/L硝酸鑭染毒組的TMS分別為50.80、50.50、49.78、45.67和45.33分。0.46和1 mmol/L硝酸鑭可使胚胎體節(jié)數(shù)減少，總形態(tài)學評分降低，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)趨勢(圖2)。

圖1 硝酸鑭對大鼠胚胎生長的影響

圖2 硝酸鑭對大鼠胚胎形態(tài)學(TMS)評分及體節(jié)數(shù)的影響

體視顯微鏡下觀察各組胚胎發(fā)現(xiàn)，對照組胚胎卵黃囊血管豐富、形態(tài)清晰，胚胎形態(tài)及各器官系統(tǒng)均發(fā)育正常，0.12 mmol/L組與對照組無明顯差異。隨劑量升高，胚胎體積逐漸減小，且0.46 mmol/L硝酸鑭染毒可使胚胎產(chǎn)生卵黃囊血管缺陷以及頭小且向后彎曲等發(fā)育畸形，1 mmol/L硝酸鑭染毒使胚胎臍、卵動脈不可見，且產(chǎn)生背中線不規(guī)則、體屈不足、尾充血、后肢芽缺失等發(fā)育畸形(圖3)。提示較高濃度硝酸鑭可能導致胚胎發(fā)育不良，具有胚胎發(fā)育毒性。

圖3 硝酸鑭對大鼠胚胎形態(tài)發(fā)育的影響

如表1所示，0.46 mmol/L以上濃度硝酸鑭染毒組的胚胎出現(xiàn)前、后肢芽不可見、體節(jié)數(shù)減少等畸形，除此之外1 mmol/L硝酸鑭染毒組胚胎還出現(xiàn)了卵黃囊血管及尿囊循環(huán)發(fā)育畸形及體屈異常等，提示較高濃度硝酸鑭可能對大鼠胚胎的血管發(fā)育、營養(yǎng)輸送及骨骼系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

2.3 全胚胎培養(yǎng)模型對硝酸鑭發(fā)育毒性的評價

圖4 硝酸鑭對BALB/c 3T3細胞增殖活性的影響

表1 硝酸鑭對大鼠胚胎各器官系統(tǒng)形態(tài)學評分的影響

如圖4所示，1.85和2.31 mmol/L硝酸鑭可顯著降低BALB/c 3T3細胞的增殖活性。經(jīng)GraphPad Prism 7軟件進行擬合計算出本模型中硝酸鑭的IC50，mal為0.34 mmol/L(110.50 μg/mL)， ICNOEC，TMS為 0.12 mmol/L(39.00 μg/mL)，ICmax為 1 mmol/L(325.00 μg/mL)，IC50，3T3為1.58 mmol/L(513.50 μg/mL)。根據(jù)以上評價指標，代入全胚胎培養(yǎng)預測模型PM1和PM2，均顯示硝酸鑭為弱胚胎發(fā)育毒性化學物。

2.4 硝酸鑭對肢芽細胞增殖和分化的影響

5-FU對肢芽細胞的增殖和分化均有明顯抑制效應(圖5、6)，經(jīng)GraphPad Prism 7軟件擬合計算出5-FU的ID50為90.85 ng/mL，代入微團培養(yǎng)模型的發(fā)育毒性預測判別式得出：5-FU為強發(fā)育毒性物質(zhì)，符合該預測模型的建立標準，證明該模型建立成功。

圖6 5-FU對肢芽微團形成的影響

如圖7、8所示，2 mmol/L及以上濃度的硝酸鑭可引起大鼠微團肢芽細胞增殖能力明顯降低，其IC50為1.57 mmol/L(510.25 μg/mL)。0.5 mmol/L 及以上濃度硝酸鑭可降低大鼠肢芽細胞分化為軟骨細胞的能力，并對微團形成數(shù)目產(chǎn)生影響，隨硝酸鑭劑量升高，單個微團體積逐漸減小，軟骨細胞阿利新藍著色度逐漸降低，至2 mmol/L組已無微團形成，但其對細胞遷移無明顯影響。

2.5 微團培養(yǎng)模型對硝酸鑭發(fā)育毒性的評價

經(jīng)GraphPad Prism 7軟件擬合得出硝酸鑭的ID50為0.99 mmol/L(321.75 μg/mL)。代入微團培養(yǎng)模型的發(fā)育毒性預測判別式，顯示硝酸鑭為無胚胎發(fā)育毒性化學物。

圖7 硝酸鑭對肢芽細胞分化的影響

圖8 硝酸鑭對肢芽微團分化的影響

3 討論

全胚胎培養(yǎng)和微團培養(yǎng)模型為發(fā)育毒性的體外替代方法，具有耗時短、花費少，靈敏度高等特點，更符合動物實驗的福利倫理及“3R”原則。全胚胎培養(yǎng)模型通過完整、獨立的胚胎培養(yǎng)體系，模擬生物體胚胎發(fā)育早期(GD 9.5～11.5)對受試物的暴露過程，通過評價胚胎形態(tài)和多器官系統(tǒng)的整體發(fā)育，可評估化學物質(zhì)對器官發(fā)生關(guān)鍵時間窗內(nèi)胚胎發(fā)育的影響。微團培養(yǎng)模型通過在體外對胚胎肢芽原代細胞以高密度共培養(yǎng)的方式，模擬體內(nèi)發(fā)育過程，可研究細胞-細胞通訊、細胞分化和細胞與胞外基質(zhì)的相互作用等[16]，通過對肢芽細胞向軟骨細胞分化能力的影響的評價，判斷受試物在胚胎發(fā)育中晚期(GD 13～18)是否具有潛在的發(fā)育毒性。本研究利用上述兩種方法，評估了硝酸鑭對大鼠胚胎的發(fā)育毒性。

研究表明，鑭可在圍著床期(GD 4～6)顯著降低小鼠受孕成功率及平均胎產(chǎn)仔數(shù)[12]，且可導致海膽早期生命階段胚胎發(fā)育缺陷[10]。本研究中，0.46 mmol/L及以上濃度的硝酸鑭可對大鼠胚胎YSD、CRL和HL產(chǎn)生明顯影響，具有明顯的生長遲滯效應，且可誘導胚胎產(chǎn)生發(fā)育畸形，尤其是血管發(fā)育、營養(yǎng)輸送及骨骼系統(tǒng)發(fā)育方面效應顯著，表明硝酸鑭在高劑量下具有一定的胚胎早期發(fā)育毒性。

ECVAM在全胚胎模型驗證過程中根據(jù)胚胎的分化及發(fā)育情況建立了預測模型1(PM1)，后引入小鼠胚胎成纖維細胞毒性數(shù)據(jù)建立了預測模型2(PM2)，完善了受試物胚胎發(fā)育毒性的預測。本研究中，全胚胎培養(yǎng)的兩個預測模型均判定硝酸鑭為弱胚胎早期發(fā)育毒性化學物。

根據(jù)硝酸鑭對BALB/c 3T3細胞毒性測試的結(jié)果，硝酸鑭對BALB/c 3T3細胞增殖的未觀察到有害效應的最大水平(no observed adverse effect level，NOAEL)為0.92 mmol/L，遠高于其對胚胎生長發(fā)育的ICNOEC，TMS和 IC50，mal，表明硝酸鑭誘導的胚胎生長遲緩和發(fā)育畸形并非由其細胞毒性所致。

臟層卵黃囊(visceral yolk sac，VYS)作為嚙齒類動物母體與胚胎之間營養(yǎng)物質(zhì)、廢物和氣體交換系統(tǒng)，在胚胎生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[17]。臟層卵黃囊間質(zhì)層的卵黃囊血管，為營養(yǎng)物質(zhì)向胚胎的輸送提供直接通道[18]，硝酸鑭對卵黃囊血管發(fā)育的抑制作用可能是導致其誘導胚胎生長遲緩的原因之一，對于其具體的作用機制有待進一步研究。

研究[19]表明稀土氯化釔可致金黃地鼠子代產(chǎn)生外觀畸形及骨骼損傷，如骨質(zhì)溶解、肋骨增生及成骨不良。本研究結(jié)果顯示，1 mmol/L及以下濃度硝酸鑭對肢芽細胞增殖無明顯影響，而0.5 mmol/L以上濃度硝酸鑭可降低肢芽細胞的分化能力，對微團形成數(shù)目及其形態(tài)產(chǎn)生影響，且相對而言，肢芽細胞分化較細胞增殖更為敏感，提示較高劑量硝酸鑭有可能導致大鼠胚胎肢芽細胞分化為軟骨細胞過程受阻。結(jié)合全胚胎培養(yǎng)模型中硝酸鑭對胚胎肢芽分化的抑制效應，提示高濃度硝酸鑭可能對肢芽細胞生長及再聚合具有一定影響，可能對胚胎骨骼系統(tǒng)發(fā)育具有一定抑制效應。

本研究中，微團培養(yǎng)預測模型判定硝酸鑭為無胚胎中晚期發(fā)育毒性化學物。根據(jù)ECVAM關(guān)于微團培養(yǎng)的另一模型[15]中的提示，若IC50和ID50的比值大于2，說明該物質(zhì)具有特異的潛在致畸性；若比值小于2，說明該物質(zhì)的發(fā)育毒性可能是由于細胞毒性引起的。硝酸鑭IC50和ID50的比值為1.59，其ID50值較高，表明其在較高濃度下對肢芽細胞分化的阻滯效應可能是由細胞毒性引起的，不一定具有實際意義。

據(jù)研究，稀土礦區(qū)居民血液中鑭元素含量平均為1.71 μg/L，最高為 18.23 μg/L[20]。研究表明[21]，稀土經(jīng)血液輸送至各器官后在體內(nèi)呈不均勻分布，具有明顯的組織特異性。鑭元素主要沉積于肝臟和骨骼(分別占吸收量的50%和25%)，遠高于其在血液中的濃度[22-23]。波蘭的一項研究顯示[24]，人初乳中鑭元素含量平均為7.1 μg/L，最高為51 μg/L，提示鑭在母乳中具有較高的蓄積量，可通過母乳喂養(yǎng)的方式進入嬰幼兒體內(nèi)。盡管本研究中鑭元素對胚胎生長發(fā)育的NOAEL為0.12 mmol/L(16.68 μg/mL)，高于礦區(qū)居民平均暴露水平，但由于其具有較強的蓄積能力且半衰期較長[25]，因此由鑭元素蓄積導致的高暴露風險不容忽視。

綜上所述，可初步認為硝酸鑭對早期胚胎發(fā)育有弱的毒性。但由于本實驗采取的兩種替代方法均為體外試驗，不能分析母體代謝、母體-胎兒間相互作用等影響，且ECVAM對發(fā)育毒性體外替代方法的驗證也認為替代方法在強發(fā)育毒性化學物的判斷上準確性較好，但不能準確判別弱發(fā)育毒性化學物和無發(fā)育毒性化學物。硝酸鑭的發(fā)育毒性還需要更多的實驗進一步確認。