P16/Ki-67雙染聯(lián)合DNA倍體分析在ASCUS分流診斷中的應(yīng)用價(jià)值

尹 璐，馬成斌，劉 平，張 祎，*，趙學(xué)軍

(1．上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，上海200051；2．上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院病理科，上海 200051)

在宮頸細(xì)胞檢查中可經(jīng)常觀察到意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)，它既可以提示有HPV感染，宮頸上皮內(nèi)瘤變，甚至是宮頸癌，也可能與炎癥、細(xì)胞萎縮等有關(guān)。目前針對(duì)檢測(cè)到ASCUS的患者，主要管理策略是從中分流出更多宮頸上皮內(nèi)瘤變2級(jí)及以上(CIN2+)病變，從而優(yōu)化臨床醫(yī)師對(duì)患者的分層管理[1]。雖然病理活檢是其檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于炎性改變和宮頸癌均可出現(xiàn)ASCUS檢驗(yàn)結(jié)果異常，過(guò)多的陰道鏡活檢會(huì)加重患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、心理負(fù)擔(dān)，故臨床對(duì)ASCUS處理方法依然存在分歧[2]。99%的宮頸癌標(biāo)本中存在高危型人乳頭瘤狀病毒(high-risk humanpapillomavirus，HR-HPV)感染，HR-HPV感染是子宮頸癌及其癌前病變的主要致病因子，目前臨床主要采用HR-HPV檢測(cè)來(lái)分流診斷ASCUS。但此法亦存在特異性低、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值低等問(wèn)題，因此需要尋找新的輔助檢測(cè)方法提高ASCUS分流的準(zhǔn)確度。近年來(lái)，DNA倍體分析逐漸用于宮頸癌早期篩查工作，相對(duì)于傳統(tǒng)人工閱片具有更高的敏感性和特異性。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后情況與腫瘤抑制基因P16和增殖細(xì)胞核抗原Ki-67有關(guān)[3-4]。若在一細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)到P16和Ki-67共表達(dá)，則高度提示有高級(jí)別病變的存在，是近年來(lái)一種較新的宮頸病變檢測(cè)手段。宮頸癌或癌前病變細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變通常較晚，在不依賴于細(xì)胞形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上，結(jié)合DNA倍體分析檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)P16/Ki-67雙染檢測(cè)，可提高CIN2+及以上病變的檢出率，減少陰道鏡創(chuàng)傷性檢查。本研究通過(guò)比較DNA倍體分析檢測(cè)、細(xì)胞學(xué)P16/Ki-67雙染檢測(cè)，以宮頸活檢病理檢測(cè)結(jié)果為金指標(biāo)，來(lái)評(píng)價(jià)P16/Ki-67雙染聯(lián)合DNA倍體分析檢測(cè)在ASCUS分流處理中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例和標(biāo)本

收集2016年12月—2018年8月上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院收治的115例診斷為ASCUS的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均具有明確信息(如年齡、性別、病史等)；②經(jīng)液基細(xì)胞學(xué)檢查(liquid-based cytology test，LCT)確診為ASCUS，參考《宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]；③年齡21歲以上；④宮頸完整，且未接受過(guò)宮頸手術(shù)或物理治療；⑤無(wú)臨床懷孕疑似癥狀；⑥患者知情并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者為孕婦或處于哺乳期；②存在子宮切除術(shù)或?qū)m頸手術(shù)史；③曾進(jìn)行過(guò)盆腔放射治療；④同時(shí)參加其他臨床研究者。115例患者年齡21～70歲，平均(49.0±5.8)歲，本次研究提交上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)審核并通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1 P16/Ki-67雙染將收集來(lái)的剩余標(biāo)本在BD SurePath載玻片上制備一張薄片，采用由羅氏公司提供的全自動(dòng)免疫組化分析儀(型號(hào)為CINtec PLUS)進(jìn)行染色，試劑盒采用羅氏公司的配套試劑，即抗P16(E6H4)/Ki-67(274-11AC3)單克隆抗體雞尾酒試劑，整個(gè)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。P16定位在胞質(zhì)或胞核上，顯棕色；Ki-67定位在胞核上，顯紅色，在細(xì)胞上同時(shí)出現(xiàn)P16和Ki-67顯色才為陽(yáng)性，單獨(dú)顯色或不顯色作為陰性[6]。

1.2.2 DNA倍體檢測(cè)將宮頸脫落細(xì)胞樣本薄層制片，F(xiàn)eulgen染色后采用全自動(dòng)DNA定量分析儀(武漢呵爾醫(yī)療科技發(fā)展有限公司，SPICM-DNA型)進(jìn)行掃描，保證每張玻片掃描6 000個(gè)以上細(xì)胞核，系統(tǒng)根據(jù)不同細(xì)胞核參數(shù)進(jìn)行分類和同價(jià)，被檢測(cè)細(xì)胞中出現(xiàn)DNA指數(shù)(DNA index，DI)大于2.5的即為DNA倍體異常。

DI=全部細(xì)胞DNA的IOD值/正常細(xì)胞DNA(G0/G1)IOD均值

式中，IOD值指的是積分光密度值。針對(duì)陽(yáng)性玻片應(yīng)再次由實(shí)驗(yàn)技術(shù)員進(jìn)行逐一核對(duì)，避免系統(tǒng)將其他物質(zhì)或重疊細(xì)胞誤認(rèn)為癌細(xì)胞。

1.2.3 宮頸陰道鏡病理活檢所有患者均行陰道鏡活檢，由婦科醫(yī)師取組織后實(shí)驗(yàn)技術(shù)員將其制作成石蠟切片并進(jìn)行HE染色，分類標(biāo)準(zhǔn)：陰性，慢性宮頸炎、HPV感染等相關(guān)病變；CINI，累及鱗狀上皮的1/3；CIN2累及鱗狀上皮的2/3；CIN3，累及鱗狀上皮全層；浸潤(rùn)癌，鱗狀細(xì)胞癌、腺癌等。根據(jù)WHO制定的腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)和宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]將組織學(xué)結(jié)果CIN2級(jí)及以上病變作為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以xˉ±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用四格表法χ2檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 115例經(jīng)LCT診斷為ASCUS的患者病理檢查結(jié)果

本次研究共收集115例患者，均行陰道鏡活檢，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，部分典型結(jié)果見(jiàn)圖1。各種病理類型的例數(shù)和占比見(jiàn)表1，其中CIN2及以上病變45例，陽(yáng)性率為39.1%，陽(yáng)性病例中CIN2有20例，CIN3有23例，鱗癌2例。

圖1 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

表1 病理組織學(xué)檢查結(jié)果

2.2 P16/Ki-67雙染檢測(cè)結(jié)果

115例患者采用P16/Ki-67雙染檢測(cè)，典型雙染陽(yáng)性細(xì)胞見(jiàn)圖2。這115例患者共檢出CIN2及以上病變51例(陽(yáng)性率44.3%)，64例P16或Ki-67只在1個(gè)細(xì)胞顯色或不顯色。將陰道鏡病理檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，51例病變中35例病理檢測(cè)為CIN2及以上，見(jiàn)表2。根據(jù)表2計(jì)算P16/Ki-67雙染檢測(cè)的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度分別為77.8%、77.1%、77.4%。

圖2 P16/Ki-67雙染陽(yáng)性細(xì)胞

表2 P16/Ki-67雙染檢測(cè)結(jié)果

2.3 DNA倍體分析檢測(cè)結(jié)果

115例患者采用DNA倍體分析，其中共檢出CIN2及以上病變78例(陽(yáng)性率67.8%)，37例為CIN1及以下。將病理檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，78例病變中32例病理檢測(cè)為CIN2及以上，見(jiàn)表3。根據(jù)表3計(jì)算DNA倍體分析檢測(cè)的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度分別為71.1%、34.3%、48.7%。此外，DNA倍體分析為陰性的P16/Ki-67雙染檢測(cè)全為陰性。

表3 DNA倍體分析檢測(cè)結(jié)果

2.4 P16/Ki-67雙染聯(lián)合DNA倍體分析對(duì)CIN2+的診斷價(jià)值

P16/Ki-67雙染聯(lián)合DNA倍體分析對(duì)CIN2+病變檢測(cè)的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度分別為92.9%、71.4%、86.5%，見(jiàn)表4。根據(jù)P16/Ki-67雙染和DNA倍體分析以及聯(lián)合診斷的檢測(cè)結(jié)果，以靈敏度為縱坐標(biāo)，假陽(yáng)性率(1-特異度)為橫坐標(biāo)繪制ROC曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3，并計(jì)算得P16/Ki-67雙染檢測(cè)的AUC為0.792，DNA倍體分析檢測(cè)的AUC為0.634，兩者聯(lián)合診斷的AUC為0.856。

表4 P16/Ki-67雙染、DNA倍體分析及聯(lián)合診斷對(duì)CIN2+的診斷價(jià)值

圖3 P16/Ki-67雙染、DNA倍體分析及聯(lián)合診斷對(duì)CIN2+診斷價(jià)值的ROC曲線

3 討論

目前多項(xiàng)研究表明，有5%～22%的ASCUS患者可進(jìn)展為CIN2、CIN3或浸潤(rùn)癌。Ebisch等[7]收集了120例ASCUS患者的組織和細(xì)胞學(xué)樣本，發(fā)現(xiàn)9.2%樣本為CIN2和CIN3。Gage等[8]報(bào)道3年內(nèi)ASCUS發(fā)生高級(jí)別瘤變及以上的風(fēng)險(xiǎn)為2.6%。張?jiān)魄宓萚9]在1 185例行宮頸癌篩查的樣本中發(fā)現(xiàn)95例ASCUS，病理活檢發(fā)現(xiàn)CIN2及以上病變占ASCUS的比例為15.28%。本次研究結(jié)果顯示，115例ASCUS患者經(jīng)陰道鏡病理活檢發(fā)現(xiàn)45例CIN2及以上病變，占比39.1%，高于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)可能與選擇樣本不同有關(guān)。本次選擇樣本為經(jīng)液基細(xì)胞學(xué)(liquid-based cytology test，LCT)診斷為ASCUS的患者，且行陰道鏡病理活檢。而上述文獻(xiàn)多是對(duì)一定例數(shù)的ASCUS及以上級(jí)別的患者或嚴(yán)重宮頸糜爛、接觸性陰道出血的患者均行陰道鏡活檢的結(jié)果，因此本次研究可表現(xiàn)為標(biāo)本中CIN2及以上病變的陽(yáng)性率較高。雖然理論上宮頸細(xì)胞學(xué)異?；颊叨紤?yīng)進(jìn)行陰道鏡檢查從而識(shí)別患者是否存在相關(guān)病變，并且是否進(jìn)行陰道鏡檢查也會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響[10]，但是，一些不必要的陰道鏡檢查、病理活檢仍會(huì)給部分患者帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)，尤其是未婚、未育的患者。

P16是一種腫瘤抑癌基因的產(chǎn)物，能對(duì)腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白酶進(jìn)行抑制，在多數(shù)的宮頸癌、鱗癌、腺癌等細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，在病變等級(jí)較低或正常鱗狀細(xì)胞中呈弱陽(yáng)性或陰性[11-12]。P16定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在進(jìn)行染色的判斷時(shí)，需要參考細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，因在非腫瘤細(xì)胞中也可出現(xiàn)P16的高表達(dá)[13]。Ki-67在細(xì)胞中高表達(dá)表明此時(shí)細(xì)胞處于增殖的活躍期[14]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，宮頸病變?cè)絿?yán)重，Ki-67表達(dá)量越高，因此Ki-67可作為宮頸病變嚴(yán)重程度的判斷指標(biāo)[15]。采用P16/Ki-67雙染能有效降低P16染色誤判問(wèn)題，相關(guān)研究報(bào)道，P16/Ki-67雙染檢測(cè)宮頸癌病變具有良好的靈敏度和特異度[16]。亦有相關(guān)報(bào)道指出，P16/Ki-67雙染技術(shù)的靈敏度與特異性均高于細(xì)胞學(xué)。Robial等[17]在總結(jié)了多篇關(guān)于P16/Ki-67雙染檢測(cè)宮頸癌的文章發(fā)現(xiàn)，P16/Ki-67雙染檢測(cè)CIN2及以上的靈敏度和特異度分別在60%～90%和50%～80%的范圍之間。而本次研究中P16/Ki-67雙染檢測(cè)CIN2及以上的靈敏度和特異度分別為77.8%、77.1%，與相關(guān)研究報(bào)道相符。

雖然隨著液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(thinprep cytologic test，TCT)技術(shù)的應(yīng)用，宮頸癌的發(fā)病率及死亡率都明顯下降，但TCT在篩查過(guò)程中仍然存在敏感性低的問(wèn)題。因DNA倍體檢測(cè)全自動(dòng)化、診斷標(biāo)準(zhǔn)化、客觀性，且相較于TCT檢測(cè)，具有可重復(fù)性好、敏感性和特異性高、人為誤差低、漏診率低等優(yōu)點(diǎn)，故DNA倍體檢測(cè)在歐美已成為一種常規(guī)的臨床檢測(cè)方法。但多項(xiàng)研究亦發(fā)現(xiàn)，受標(biāo)本的取材、染色、細(xì)胞數(shù)的差異及細(xì)胞的重疊等因素的影響，宮頸上皮細(xì)胞DNA非整倍體異常不足以對(duì)患者病情及預(yù)后做出判 斷[18-20]。劉峰等[21]采用DNA倍體分析預(yù)測(cè)CIN2及以上的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為33.3%，敏感度為78.4%。而本次研究中DNA倍體分析預(yù)測(cè)CIN2及以上病變的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為41.0%，敏感度為71.1%，與相關(guān)報(bào)道一致。但檢測(cè)的特異度和準(zhǔn)確度均較低，可能是檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果較多，因此臨床診療時(shí)應(yīng)配合其他檢測(cè)方法使用才能得到更好的診斷效果。

而本次研究采用P16/Ki-67雙染檢測(cè)結(jié)合DNA倍體分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)CIN2及以上病變的靈敏度和特異度均明顯高于單獨(dú)采用DNA倍體分析，同時(shí)也略高于單獨(dú)使用P16/Ki-67雙染檢測(cè)，且DNA倍體分析檢測(cè)為陰性例數(shù)在P16/Ki-67雙染檢測(cè)中也均為陰性。P16/Ki-67雙染陽(yáng)性記數(shù)雖獨(dú)立于細(xì)胞形態(tài)學(xué)，且在重復(fù)細(xì)胞學(xué)制片中存在少數(shù)病例中無(wú)陽(yáng)性特征細(xì)胞，但筆者仍認(rèn)為在可重復(fù)性的細(xì)胞學(xué)制片的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，DNA倍體分析基礎(chǔ)上進(jìn)行P16/Ki-67雙染檢測(cè)能有效減少一過(guò)性感染造成的假陽(yáng)性，從而提高宮頸高級(jí)別病變檢出率，減少陰道鏡轉(zhuǎn)診和創(chuàng)傷性宮頸活檢，尤其在醫(yī)療資源缺乏、細(xì)胞學(xué)醫(yī)師缺乏的邊遠(yuǎn)地區(qū)。

綜上所述，P16/Ki-67雙染能明顯提高CIN2+檢出的預(yù)測(cè)值，DNA倍體分析聯(lián)合P16/Ki-67雙染具有較高的靈敏度和特異度，可輔助用于ASCUS分流診斷，減少陰道鏡和活檢造成的創(chuàng)傷、減輕患者的心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，甚至成為輔助宮頸細(xì)胞學(xué)精準(zhǔn)篩查的有效方法之一。