PM2.5對L02肝細胞部分癌基因和凋亡相關基因表達的影響

秦雙建 ，李柏茹 ，蔡 穎，鄭 凱，王冰玉，李閏冰 ，肖 芳，曾 明，*，徐新云*

(1．中南大學湘雅公共衛生學院，湖南 長沙410078；2．深圳市疾病預防控制中心，廣東深圳 518055；3．南華大學公共衛生學院，湖南 衡陽 421001)

當前環境污染問題備受關注，相關研究證實，許多疾病的發生與空氣污染有著密切聯系[1]。大量流行病學、毒理學資料表明，大氣細顆粒物(particulate matter，PM2.5)作為空氣污染的主要有害成分，能引發呼吸系統炎癥甚至導致心血管系統疾病、免疫系統疾病，進而誘發各類癌癥，對人類的健康造成巨大威脅[2-4]。PM2.5的成分中大多包含多環芳烴、重金屬離子等多種具有致突變性和致癌性物質[5-7]。人群吸入PM2.5后，它不僅能在肺泡沉積或進入血液循環，甚至可經過肺換氣到達其他器官，進而導致肺外器官的損害：最終損害人體健康[8]。已有研究表明，PM2.5對肺和支氣管細胞具有明顯的致癌致突變作用[9-12]。PM2.5對于肝臟這一主要的解毒代謝器官有直接而深遠的影響。多項研究表明，暴露于PM2.5可誘導肝臟的脂質堆積、氧化應激、胰島素抵抗和炎癥反應等[13-14]。目前大量的研究表明PM2.5對肝臟各方面具有危害，因此研究PM2.5對肝細胞是否存在致癌致突變作用，具有一定的理論意義。本文采用不同劑量PM2.5對人正常L02肝細胞進行染毒，檢測癌基因(c-myc、c-fos、p53)和凋亡相關基因(Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2)在mRNA和蛋白水平的表達變化，為深入探討PM2.5致癌致突變機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

L02細胞購于中國上海細胞庫；RPMI 1640培養基、胎牛血清與0.25%Trpsin-EDTA購于美國Gibco公司；DMSO和K2CrO4購于美國Sigma公司；GAPDH、c-myc、c-fos、p53、Caspase-3、Caspase-8及Bcl-2基因PCR引物由上海生工合成；SYBR PrimeScript RT-PCR kit、 PrimeScrip RT reagent kit購 于 日 本TaKaRa公司；p53抗體(2527S)、c-myc抗體(9402S)購于美國Cell Signaling公司；c-fos抗體(SC-166940)、Caspase-3 抗體(SC-7272)、Caspase-8 抗體(SC-81656)、Bcl-2抗體(SC-7382)、β-actin抗體(SC-47778)購于美國Santa Cruz公司；二抗(羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP)購于美國Thermo Scientific公司；BCA垂直電泳系統(Mini-protean Tetra)購自美國Bio-Rad公司；7500實時熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；冷CCD成像系統購于美國GE公司；中流量大氣采樣器(TH-150CⅢ型)購自武漢市天虹儀器有限責任公司。

1.2 PM2.5采集和樣品制備

PM2.5樣品采集地點于山西太原，將直徑為80 mm的石英濾膜裝于中型流量采樣器，按100 L/min的流量，每天24 h，連續多天采樣并收集濾膜。將收集的濾膜剪成2 cm×2 cm大小于燒杯中，加入超純水致浸沒，用錫紙密封燒杯口，超聲振蕩30～40 min，留取PM2.5懸液，冷卻至室溫后裝入特定容器中，錫箔紙密封，放入-80℃冰箱冷凍24 h，取出，放在真空冷凍干燥機至完全干燥；最后放入超凈臺中照紫外燈1～2 h，加入滅菌水制備成PM2.5樣品混懸液，-20℃保存待用，使用前振蕩混勻。

1.3 細胞培養與染毒

L02細胞培養于37℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中，經細胞消化，以4.5×105/mL的細胞濃度接種到6孔板，每孔加2 mL無FBS的RPMI 1640培養基，待細胞匯合度為70%～80%時進行PM2.5懸液染毒處理。根據課題組前期進行的CCK-8細胞毒性實驗，本實驗設陰性對照組即不做處理的L02細胞、PM2.5懸液染毒的終濃度分別為10、50 μg/mL，以10 μmol/L的K2CrO4(以下用Cr6+表示)水溶液為陽性對照組，PM2.5混懸液染毒組和陽性對照組細胞均染毒24 h。

1.4 目的基因mRNA表達水平的實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測

PM2.5染毒L02細胞后，提取L02細胞總RNA并反轉錄合成cDNA，按照試劑盒說明書操作。反轉錄條件：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃、10 min，-20℃冰箱保存cDNA樣品。取各組細胞的cDNA 0.4 μL為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time PCR，qPCR)，檢測目的基因c-myc、c-fos、p53、Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2的表達。qPCR反應條件：95℃預變性30 s，共1個循環；95℃變性5 s，56℃退火延伸30 s，共40個循環；以GAPDH的CT值為內參，采用2-ΔΔCT計算各基因的相對表達量。目的基因PCR引物見表1。

表1 目的基因PCR引物序列

1.5 Western blot檢測目的蛋白表達水平

PM2.5染毒L02細胞結束后，吸取殘余培養基，用冷的PBS洗3遍，加入細胞裂解液，置于搖床上，冰上裂解30 min，并用細胞刮刷快速將裂解好的細胞刮落，收集細胞至2 mL EP管中，12 000 r/min，4℃離心25 min。加入5×SDS-PAGE，100℃變性10 min，參照 BCA法進行蛋白定量，樣品置于-20℃保存待用。配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，每個樣品按等體積上樣，兩邊的孔加入預染蛋白質marker作為相對分子質量對照，恒壓按80 V、35 min，120 V、40 min條件至電泳結束。隨后200 mA恒流轉膜90 min，再用5%的脫脂奶粉室溫下在搖床上封閉1.5 h。根據目的蛋白的大小，切取相應的條帶，配制一抗稀釋液，冰上孵育過夜；1×TBST緩沖液洗4次：每次10 min。按1∶5 000比例稀釋HPR標記的羊抗鼠、羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h；1×TBST緩沖液洗3次，每次10 min。加入ECL化學發光試劑后用冷CCD成像系統對其進行曝光拍照，所得圖像用Image J軟件進行條帶灰度值分析。

1.6 統計分析

實驗數據以均值±標準差表示，所有實驗重復3次；應用SPSS 22.0進行統計學分析，各組間(PM2.5混懸液染毒組、陽性對照組與陰性對照組)mRNA、蛋白表達水平指標間差異的分析采用單因素方差分析：LSD法進行兩兩比較，以α=0.05為檢測水準。

2 結果

2.1 PM2.5染毒后癌基因和凋亡相關基因mRNA表達水平變化

qPCR實驗的結果見圖1。與陰性對照組比較：10 μg/mL和50 μg/mL PM2.5混懸液染毒組以及陽性對照Cr6+組，c-myc mRNA表達水平分別升高69.5%、118.0%、51.1%；c-fos mRNA表達水平分別升高50.3%、64.4%、23.3%；p53 mRNA表達水平分別下降4.0%、22.0%、18.0%；Caspase-3 mRNA表達分別升高31.0%、30.5%、42.0%；Caspase-8 mRNA表達分別升高25.3%、40.3%、64.5%；Bcl-2 mRNA表達分別降低40.5%、46.9%、41.4%，差異均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

2.2 PM2.5染毒L02細胞目的蛋白表達水平變化

Western blot的檢測結果見圖2和圖3。結果表明，與陰性對照組比較，c-myc蛋白在10、50 μg/mL PM2.5混懸液和Cr6+染毒后表達水平分別升高32.3%、49.3%、70.6%；c-fos蛋白表達水平分別升高11.3%、50.2%、45.2%；p53蛋白表達水平分別下降17.5%、40.0%、42.9%；Caspase-3蛋白表達水平分別升高23.1%、33.9%、43.1%；Caspase-8蛋白表達水平分別升高31.4%、52.1%、80.0%；Bcl-2蛋白表達量分別下降14.3%、23.3%，36.9%，差異均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。

3 討論

圖1 PM2.5染毒對L02細胞c-myc、c-fos、p53、Caspase-3、Caspase-8和Bcl-2 mRNA表達水平的影響

圖2 PM2.5染毒對L02細胞c-myc、c-fos和p53蛋白表達水平的影響

圖3 PM2.5染毒對L02細胞Caspase-3、Caspase-8和Bcl-2蛋白表達水平的影響

本文結果顯示，L02細胞經陽性對照物Cr6+染毒后，c-myc、c-fos、Caspase-3、Caspase-8 mRNA及蛋白表達均明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，p53、Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。經PM2.5染毒處理后，PM2.510 μg/mL和50 μg/mL混懸液組引起 c-myc、c-fos、Caspase-3、Caspase-8 在mRNA和蛋白表達水平顯著高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)；p53、Bcl-2 mRNA和蛋白在PM2.510 μg/mL和50 μg/mL混懸液組中表達水平均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。這些結果提示大氣PM2.5對L02細胞中促癌基因和凋亡相關基因表達具有明顯促進作用，推測PM2.5致癌、致凋亡可能與通過促進癌基因和凋亡相關基因表達有關。

我國經濟快速發展，嚴重的環境污染和癌癥頻發、高發等問題接踵而至[15]，而PM2.5常被用于評估空氣污染的嚴重程度[16]。PM2.5的來源及組分很復雜，如果長期吸入PM2.5污染的空氣，可造成人體多系統功能性和器質性的損傷。原癌基因是一種廣泛存在于真核細胞、可經反轉錄病毒轉導成為致癌活性的癌基因[17]。c-myc可通過調節致癌等相關基因的表達，參與惡性轉化和腫瘤進展。每年約70 000例美國癌癥死亡病例中發現了c-myc基因改變，其中包括肝細胞癌[18]。正常細胞中c-fos基因表達水平較低，而在炎癥細胞中受炎癥介質的刺激，引起c-fos基因快速表達[19]。正常情況下，p53蛋白是抑癌因子，調控生命活動的各個方面。Caspase-8與Caspase-3在Caspase級聯反應中處于核心地位，是細胞凋亡發生的關鍵步驟及傳導的共同通路。Caspase-8與Caspase-3在已知的TRAIL/TRAIL-R介導的細胞凋亡途徑中也同樣起重要作用[20]。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調節中發揮著關鍵作用，且Bcl-2高表達時可明顯抑制細胞凋亡。

目前大氣污染與癌癥發病存在密切聯系，雖然現有大部分研究主要針對PM2.5與呼吸系統疾病，探討PM2.5致癌分子機制，但由于PM2.5對人體多器官多系統都存在健康危害，因此本文采用PM2.5染毒L02細胞，開展PM2.5對L02肝細胞相關癌基因和凋亡相關基因表達影響的研究，結果表明PM2.5染毒引起L02肝細胞中促癌基因和促凋亡相關基因表達升高，抑癌基因和抑凋亡相關基因表達下降，提示PM2.5對L02肝細胞促凋亡相關基因和促癌基因具有一定的促進與激活作用。本研究結果對于今后進一步深入探討PM2.5的健康危害，具有一定的理論意義和應用價值。