miR-21通過靶向PDCD4調控三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲

陳綿齡，馬碩一

(1．廣州市第一人民醫院，華南理工大學附屬第二醫院乳腺外科，廣東 廣州 510180；2．廣州市第一人民醫院，華南理工大學附屬第二醫院介入科，廣東 廣州 510180)

乳腺癌是導致全世界女性癌癥死亡的主要原因。在中國，乳腺癌的發病率居女性惡性腫瘤的首位。三陰性乳腺癌是乳腺癌中惡性程度較高的一種亞型，預后較差，由于其缺少雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progestrogen receptor，PR)和人表皮生長因子受體-2(human epithelial growth factor receptor-2，HER-2)的表達，內分泌治療和針對HER2的靶向治療無效，因此尋找新的治療靶點具有重要意義。

小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)是一組具有長21～23個核苷酸的非編碼單鏈RNA，可以調控多個重要的生物學過程，比如癌細胞生長、凋亡和轉移等。其中，miR-21在多種癌癥中過度表達并且起促癌作用，包括乳腺癌[1-2]、肝癌[3]、胰腺癌[4]和結直腸癌[5]等。研究發現，在HER-2陽性的乳腺癌患者中，miR-21通過調節上皮-間充質轉化影響患者對曲妥珠單抗治療和化療的反應[6]。

程序性細胞凋亡因子4基因(programmed cell death 4，PDCD4)是凋亡因子家族的成員之一，其表達的丟失和多種腫瘤的發生和進展相關，包括膠質瘤[7]、膠質母細胞瘤[8]和卵巢癌[9]等。在細胞的凋亡過程中，過度表達的PDCD4蛋白可以抑制癌細胞的腫瘤源性。在ER陽性乳腺癌中，PDCD4下調和芳香化酶抑制劑耐藥以及較差的預后相關[10]。

研究表明在乳腺癌細胞中PDCD4是miR-21的功能性靶點，miR-21可以抑制乳腺癌細胞生長[11]。但是，目前尚無研究揭示miR-21靶向PDCD4調控三陰性乳腺癌增殖、遷移和侵襲。因此本研究擬探討miR-21和PDCD4在三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231和正常乳腺細胞MCF-10A中的表達，以及miR-21是否靶向調控PDCD4影響MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲。本研究為進一步闡明乳腺癌轉移的分子機制提供一定的依據，miR-21可能成為抑制三陰性乳腺癌轉移的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

馬血清，購于美國Gibco公司；表皮生長因子、霍亂毒素、胰島素、氫化可的松、DMEM培養基、胰酶，Trizol裂解液、LipofectamineTMRNAiMAX，購于美國Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix購自日本TOYOBO公司；Taqman microRNA試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；熒光素酶報告檢測試劑盒購自美國Promega公司；鼠β-actin蛋白購自美國Abcam公司；Transwell小室購自美國Corning公司；miR-21模擬物(mimics)、miR-21抑制物(inhibitor)以及模擬物對照、抑制物對照購自廣州銳博生物科技有限公司；ABI PRISM?7500 Sequence Detection System購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 細胞培養

人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231，購自中科院上海細胞庫，用含1%青霉素/慶大霉素和1%谷氨酰胺的DMEM培養基培養。人類正常乳腺細胞系MCF-10A購自美國ATCC公司，用含5%馬血清、20 ng/mL表皮生長因子、0.1 mg/mL霍亂毒素、10 mg/mL胰島素和500 ng/mL氫化可的松的DMEM培養基培養。兩種細胞均在37℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養。

1.3 實時定量PCR檢測miR-21和PDCD4 mRNA的表達

采用Trizol裂解液提取MDA-MB-231和MCF-10A細胞中的總RNA，通過逆轉錄試劑盒合成cDNA。采用Primer Epress 3.0軟件設計引物，PDCD4和內參18S rRNA的引物信息，以及miR-21和內參U6的引物信息見表1。PCR擴增反應體系總體積為20 μL，包括5.0 μL cDNA、0.5 μL上游引物和0.5 μL下游引物、10 μL SYBR Green PCR Master Mix(2×)和 4 μL dH2O。PCR反應條件為：95℃預變性5 min；95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、32 s，40個循環；72℃延伸5 min。產物在ABI PRISM?7500儀器上檢測CT值。miR-21的表達采用Taqman microRNA assays定量檢測[12]。產物的相對表達采用 2-ΔΔCT法計算。所有的實時定量PCR(quantitativereal-time PCR，qPCR)反應均重復3次。

將MDA-MB-231細胞接種至6孔板，待細胞匯合率約為60%時，隨機分為5組：空白對照組，轉染miR-21模擬物組，模擬物對照組，轉染miR-21抑制物組和抑制物對照組。轉染方法參照LipofectamineTMRNAiMAX試劑說明書進行。將1.25 μL miR-21抑制物或模擬物或陰性對照在100 μL Opti-MEM培養基內溶解，加入2 μL LipofectamineTMRNAiMAX試劑。轉染結束后，提取總RNA，采用qPCR檢測PDCD4 mRNA的表達量。

表1 用于檢測PDCD4 mRNA和miR-21的qPCR引物

1.4 Western blot法檢測PDCD4蛋白的表達

將MDA-MB-231細胞接種至6孔板，待細胞匯合率約為60%時，隨機分為5組：空白對照組，轉染miR-21模擬物組，模擬物對照組，轉染miR-21抑制物組和抑制物對照組。轉染方法參照LipofectamineTMRNAiMAX試劑說明書進行。分別將1.25 μL miR-21抑制物、模擬物或陰性對照在100 μL Opti-MEM培養基內溶解，加入2 μL LipofectamineTMRNAiMAX試劑。轉染結束后，細胞用PBS洗3次，然后將6孔板置于冰上，每孔加入150 μL蛋白裂解液，裂解完全后用細胞刮將細胞收集至1.5 mL EP管中，離心，取上清備用。蛋白樣品經SDS-PAGE電泳分離后采用濕轉法轉移到硝酸纖維素膜。醋酸纖維膜經過室溫封閉(5%脫脂奶粉)2 h后，置于搖床上用PBST溶液洗膜3次(每次 10 min)，分別加入 PDCD4、β-actin 抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶3 000稀釋)在37℃孵育1 h。洗膜后，醋酸纖維膜置于ECL發光液中顯影，采用化學熒光成像系統及配套軟件采集圖像。每組設3個復孔，每次實驗重復3次。

1.5 熒光素酶報告基因試劑盒檢測miR-21與PDCD4的靶向性

利用microRNA靶標網站(http://www.microrna.org/microrna/home.do)發現miR-21有一個位置被預測和PDCD4 3′-UTR 相連接(圖 1)，預測 miR-21 靶向PDCD4。

圖1 預測miR-21和PDCD4 3′-UTR有一處連接

將PDCD4的3′-UTR區和突變3′-UTR區構建雙熒光素酶報告載體。MDA-MB-231細胞接種在24孔板中，每孔1×105個細胞，將熒光素酶報告載體分別與miR-21抑制物、miR-21模擬物共轉染細胞。轉染24 h后用熒光素酶報告檢測系統檢測熒光素酶的活性。所有實驗重復3次。

1.6 Transwell小室實驗檢測遷移和侵襲的細胞數目

1.6.1 遷移實驗收集1×105個饑餓狀態的MDAMB-231細胞，用100 μL無血清DMEM培養基重懸，加入Transwell小室的上室，在下室加入600 μL DMEM完全培養基。在培養箱中培養12～48 h后，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌1次，結晶紫染色10 min，PBS洗滌1次，顯微鏡下觀察細胞是否穿過小孔，如有穿過終止其他實驗組，并拍照統計。

1.6.2 侵襲實驗Transwell上層小室鋪一層Matrigel，其余操作同遷移實驗。

1.7 統計學分析

所有實驗結果采用±s表示。MDA-MB-231細胞組和MCF-10A細胞組miR-21和PDCD4指標間差異的分析采用t檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 miR-21和PDCD4在MDA-MB-231和MCF-10A細胞中表達的差異

我們檢測了MDA-MB-231細胞和MCF-10A細胞中miR-21和PDCD4的表達。結果顯示miR-21的相對表達水平在MDA-MB-231細胞中顯著高于MCF-10A細胞(P＜0.01，圖 2A)。PDCD4 mRNA 在 MDA-MB-231細胞中的表達顯著低于MCF-10A細胞(P＜0.01，圖2B)。

圖2 兩種細胞中miR-21和PDCD4 mRNA的表達

2.2 MDA-MB-231細胞中miR-21靶向調控PDCD4的表達

為了研究miR-21和PDCD4之間的關系，我們分別增強和抑制了miR-21在MDA-MB-231細胞中的表達。qPCR結果顯示MDA-MB-231細胞轉染miR-21模擬物增強miR-21的表達后，PDCD4的表達在mRNA水平和蛋白水平均降低。反之，轉染miR-21抑制物抑制miR-21的表達后，PDCD4的表達在mRNA水平和蛋白水平明顯升高(圖3A、B)。

熒光素酶報告基因檢測顯示過表達miR-21明顯抑制PDCD4基因的熒光素酶活性(P＜0.05)(圖3C)，而將PDCD4的3′-UTR區突變后，PDCD4基因的活性未受到影響(圖 3D)。

2.3 miR-21促進MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲

遷移實驗結果顯示，與空白對照組比較，轉染miR-21模擬物過表達miR-21后，MDA-MB-231細胞遷移能力增強；而轉染miR-21抑制物抑制miR-21的表達后，細胞遷移能力下降(圖4A、B)。

圖3 MDA-MB-231細胞中miR-21靶向調控PDCD4的表達

侵襲實驗結果顯示，與對照組相比，miR-21模擬物轉染的MDA-MB-231細胞侵襲能力增強。miR-21抑制物轉染的MDA-MB-231細胞侵襲能力下降(圖4A、C)。

圖4 不同組MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力

3 討論

近年來microRNA是腫瘤學的研究熱點，在許多惡性腫瘤里起到抑癌或者促癌的作用。這些研究為揭示癌癥發生發展的分子機制和探索新的治療方法帶來了新的視角。miR-21在多種腫瘤里具有促癌作用[13-14]。PDCD4基因位于人類10q24染色體，編碼185個氨基酸[15]，可以抑制細胞的增殖[16]，增加細胞凋亡[17]。研究發現，PDCD4基因是一個抑癌基因，在各種癌癥中表達下調[18-20]，能促進癌細胞凋亡、抑制癌細胞增殖和轉移[21-24]。PDCD4抑制癌細胞的轉移，其機制可能與下調MAP4K1(有絲分裂原激活的蛋白4激酶1)表達相關[25]。Yu等[26]發現，在胃癌細胞中，幽門螺桿菌通過抑制PDCD4表達來誘導上皮間質轉化(EMT)有關。Frankel等[1]發現PDCD4在乳腺癌細胞MCF-7中是miR-21的重要靶點。

我們的研究發現在三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231中miR-21可以調控細胞的遷移和侵襲，具有促癌作用，提示miR-21-PDCD4通路可能成為治療三陰性乳腺癌的靶點。本研究發現miR-21在MDA-MB-231細胞表達高于正常乳腺細胞MCF-10A。我們進一步探索miR-21在MDA-MB-231細胞中的作用靶點。Target Scan數據庫預測miR-21和PDCD4基因3′-UTR有一個連接點。我們首先檢測PDCD4的表達，結果發現PDCD4 mRNA在MDA-MB-231細胞中表達水平低于MCF-10A細胞。然后我們采用熒光素酶報告基因實驗證實了PDCD4是miR-21的靶基因。通過轉染miR-21抑制物，可以觀察到PDCD4 mRNA表達升高，而轉染miR-21模擬物觀察到PDCD4 mRNA降低。這些結果顯示miR-21在轉錄后調控PDCD4的表達。

在轉染miR-21模擬物/抑制物后，我們同時進行細胞遷移和侵襲的研究。結果發現轉染miR-21模擬物后，細胞遷移和侵襲能力均較空白對照組和未轉染的MDA-MB-231細胞顯著升高。而轉染miR-21抑制物后，細胞遷移和侵襲能力均較空白對照組和未轉染的原始MDA-MB-231細胞顯著降低。這些結果顯示，miR-21在調控MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲中發揮重要作用。

綜上所述，我們發現在三陰性乳腺癌細胞MDAMB-231中，miR-21通過靶向PDCD4調控細胞的遷移和轉移。通過調控miR-21的表達可能成為新的三陰性乳腺癌治療方法。