在線固相萃取/高分辨質譜快速分析三文魚中氧氟沙星殘留量

祝偉霞， 楊冀州， 魏 蔚， 王新輝， 張淑霞

(鄭州海關技術中心，鄭州450003)

氧氟沙星（ofloxacin）是第二代氟喹諾酮類藥物，對革蘭氏陰性/陽性菌具有抗菌活性，主要用于水產養殖疾病的防治[1]。氧氟沙星易在動物體內殘留，長期食用含有該藥物殘留的食品，可危害人類健康[2]。三文魚以其獨特的口味、豐富的營養，受到越來越多人的青睞。據聯合國糧農組織統計，目前全球超過70%三文魚來自于水產養殖業[3]。為保障人類身體健康，2015年我國農業部第2292號公告禁止氧氟沙星用于水產養殖過程中。我國是三文魚的主要進口國家，為保障國內水產品的質量安全，急需建立三文魚中氧氟沙星殘留量的分析方法。

目前有關氧氟沙星的研究報道主要采用拉曼光譜法[4]、電化學法[5]、毛細管電泳法[6]、液相色譜法[7-10]和液相色譜-質譜/質譜法[11]。水產品中氧氟沙星殘留測定需要液液萃取與離線固相萃取前處理方法[8-9]，操作繁瑣，目前未見有關三文魚中氧氟沙星殘留量全自動分析的文獻報道。為了提高分析效率，本方法設計了一種在線固相萃取凈化方法，可以快速測定三文魚中氧氟沙星的殘留。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

TranscendTM在線凈化液相色譜聯合四極桿/靜電場軌道阱質譜儀（美國Thermo Fisher公司）；T18渦旋混勻器(德國IKA公司)；3-16KL型離心機（日本Sigma公司）；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司)；氧氟沙星標準品 (CAS 82419-36-1) 購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸(96%)和乙腈(色譜純，美國Fisher公司)。

1.2 標準溶液的準備

稱取氧氟沙星標準品10 mg加入甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，該標準溶液質量濃度為100 μg/mL，該溶液于-18 ℃以下保存，可穩定6個月。取上述標準溶液配制成質量濃度為1.0 μg/mL中間標準溶液，2 ℃～4 ℃保存，可穩定1個月。用水-乙腈（9:1）將中間標準溶液稀釋成適當濃度的標準工作溶液。

1.3 儀器參數

在線固相萃取凈化色譜柱為CycloneTM(50 mm×0.5 mm)；進樣體積為50 μL；液相分離色譜柱為SHISEIDO CAPCELL MG Ⅱ(150 mm×2.0 mm,3.0 μm)；進樣量為50 μL，TurboFlow上樣泵流動相、HPLC流動相、其它儀器條件見表1。

表1 測定氧氟沙星oneline-SPE凈化和色譜條件Table 1 Online -SPE conditions and HPLC parameters of Ofloxacin

檢測器：四極桿-靜電場軌道阱；離子化：正離子電噴霧（ESI+）；離子源溫度：300 ℃；毛細管溫度：350℃；噴霧電壓：3400 V；鞘氣：45 psi；輔助氣：15 psi；質量掃描范圍：m/z 200 amu～400 amu；監測模式：全自動觸發二級掃描(dd-MS2)；母離子掃描分辨率為70000，子離子分辨率和閾值為17500和100000；碰撞能量為35 eV；氧氟沙星理論分子量365.1516，檢測分子量362.1511，質量精度1.4 ppm，特征子離子318.1612和261.1034。

1.4 樣品前處理

準確稱取1.0 g勻質樣品，加入4 mL乙腈混勻，超聲提取10 min，4000 r/min離心2 min，取上清液氮吹至干燥，1 mL乙腈-水（9:1）溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，上機測定。

2 結果討論

2.1 在線固相萃取條件的優化

氧氟沙星屬中等極性的疏水物質，SPE方法常主要采用反相固相萃取和陽離子固相萃取柱凈化。Turboflow技術是基于渦流色譜原理的樣品制備方法，結合了擴散、化學吸附和體積排阻原理，在捕獲目標化合物的同時快速除去復雜樣品中的蛋白質及核酸等大分子物質，并消除基質干擾。實驗采用不同在線固相萃取柱Cyclone（1×50 mm）、Cyclone-P（1×50 mm）和HTLC-C18（1×50 mm）進行了對比，發現Cyclone（1×50 mm）柱對分析物的保留作用最強，實驗選擇Cyclone（1×50 mm）柱為萃取柱。

實驗分別試驗了0.1%甲酸、水和0.1%氨水作為上樣溶劑的效果。結果表明水為上樣溶劑時，氧氟沙星保留最高，0.1%甲酸和0.1%氨水為上樣溶劑時，分析物在固相萃取柱上的相對保留降低21.7%～46.2%。

實驗比較了不同比例乙腈-0.1%甲酸溶液的洗脫效果。結果表明采用乙腈-0.1%甲酸（6:4）為洗脫溶劑，氧氟沙星回收率95.7%（見圖1），當乙腈比例增加至100%，回收率無顯著變化。考慮到目標物在分析柱柱頭的聚焦，實驗選擇較低比例有機相，乙腈-0.1%甲酸（6:4）洗脫溶劑分析物可得到良好的峰形。

2.2 方法驗證

方法采用不含氧氟沙星殘留的三文魚樣品添加3種濃度水平進行檢測，測得方法的最低檢出濃度，經實驗方法定量限為2.0 μg/kg。試驗在三文魚樣品基質中添加3種濃度范圍的標準溶液，測得線性范圍1.0 μg/kg～100 μg/kg線性范圍內，分析物的濃度與其峰面積呈良好的線性關系Y=8472X+1234(R=0.9994)。

試驗選取陰性三文魚分別在定量限、2倍定量限和5倍定量限濃度水平進行加標回收試驗，每個濃度水平平行測定10次，方法回收率為68.7%～102.4%，相對標準偏差在6.7%～12.8%之間。

2.3 實際樣品的測定

為驗證該方法的有效性，收集了48份三文魚樣品進行分析。按照上述方法操作，根據保留時間和高分辨精確分子量進行確證，未檢出氧氟沙星殘留。本方法的分析結果與現行國家標準方法分析結果一致。

3 結論

該方法聯合采用在線固相萃取凈化與液相色譜-四極桿/高分辨靜電場串聯質譜技術，建立了三文魚中氧氟沙星殘留的鑒定方法，依靠高分辨精確母離子和二級精確子離子進行定性和定量，測定結果準確度誤差小于5 ppm。經采用實際樣品進行分析，證明本方法分析速度快，準確度高，可用于三文魚中氧氟沙星的快速測定和確證。