中國西部漢族人群血小板源性生長因子C基因單核苷酸多態性與非綜合征型唇腭裂相關性研究

周玉蘭 朱文超 石冰 賈仲林

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心

四川大學華西口腔醫院唇腭裂外科，成都 610041

唇腭裂（cleft lip with or without cleft palate，CL/P）是人類最常見的顱面部先天性畸形之一，統計數據顯示全世界每700個新生兒中就有一個唇腭裂患者[1]。在中國，其發病率約為1.67‰[2]。根據有無其他全身性先天畸形的伴發，可以將其分為綜合征型唇腭裂（syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P）和非綜合征型唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）[3]。SCL/P表型較NSCL/P復雜，大多符合孟德爾單基因遺傳模式；約70%的CL/P為NSCL/P，患者無身體其他部位的畸形，是由多基因突變、有害環境因素及其相互作用導致的復雜疾病[3]。只有當多種危險因素的共同作用達到閾值時，NSCL/P才會發生。NSCL/P的易感基因和區域逐漸被發現，候選基因不斷增多。在目前已發現的眾多候選基因和信號傳遞通路中，研究較多的有干擾素調節因子6（interferon regulatory factor-6，IRF-6）、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-3、同源異性盒基因1（Msh homeobox1，MSX1）、甲狀腺轉錄因子1（forkhead box E1，FOX-E1）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）家族、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）4、 v-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物B（v-maf musculoaponeurotic fi bro sarcoma oncogene homolog B，MAFB）、鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）533、ABCA4（ATP binding cassette subfamily A member 4）、VAX1（ventral anterior homeobox 1）、SPRY2（sprouty RTK signaling antagonist 2）等基因[4-13]。

血小板源性生長因子C（platelet-derived growth factor-C，PDGF-C）屬于血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）家族成員，通過PDGF受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGF-R）-α和α二聚體信號通路在胚胎和出生后發育過程中參與多種細胞功能。研究[14]表明，rs28999109位點位于4q32，即PDGF-C基因的調控區域，與NSCL/P發生密切相關。PDGF-C基因敲除小鼠模型出現了腭裂表型，表明PDGF-C基因在腭形成中具有作用[15]。Wu等[16]納入214個唇腭裂患者—父母三人家系，研究發現24例患者有CL/P陽性家族史，TDT分析表明PDGF-C的rs17035464位點的A等位基因在母系遺傳過剩，而父系遺傳不足，提出PDGF-C基因與NSCL/P之間存在關聯。目前尚未見PDGF-C基因與中國西部漢族人群NSCL/P發生的相關性報道。

另外，環境因素在NSCL/P發生中占據重要地位這一理論也得到了大量研究的證實，但其與遺傳因素在NSCL/P發生過程中是否存在交互作用的研究較少。Zeng等[3]納入294個NSCL/P家系及183個對照家系，研究發現妊娠前3個月吸煙環境、感冒史、飲酒史是患NSCL/P的危險因素，而母親補充鈣是一個保護因素，并未發現EYA1基因與環境因素存在相互作用的證據。研究[17]表明，妊娠前3個月母體暴露于農毒素環境與GREM1基因rs16969816位點之間有顯著的交互作用；孩子攜帶A等位基因和母親孕期暴露于農毒素環境，與未暴露者相比，其患NSCL/P風險顯著增加。學者[18]提出，孕婦被動吸煙是NSCL/P的危險因素；孕婦補充多種維生素是一個保護因素；BMP4基因T538C位點與母體被動吸煙具有協同效應，為NSCL/P由遺傳和環境因素共同決定提供了新的證據。孕期適當的葉酸攝入、適當的生育年齡和文化程度高是NSCL/P的保護因素，而家族史、流產史和孕期的藥物濫用是NSCL/P的有害因素[19]。但是，目前國內外學者對PDGF-C基因與環境暴露因素之間是否存在交互作用尚無研究。

由于NSCL/P遺傳異質性的存在，本研究從人類基因組計劃數據庫中選取PDGF-C基因雜合度大于20%的2個靶向單核苷酸多態性（single nucleo tide polymorphisms，SNPs）位點（rs4691383和rs7667857）進行遺傳統計學分析，探討中國西部人群中PDGF-C基因與NSCL/P發生的相關性；同時，本研究還對患者母親孕期情況進行調查，對PDGF-C基因的2個SNPs位點基因型和環境暴露因素之間是否存在交互作用進行條件Logistic回歸分析，探討在NSCL/P發生中基因—環境暴露因素是否存在相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象和實驗設計

收集2011年3月—2018年4月于四川大學華西口腔醫院唇腭裂外科住院手術治療的268個NSCL/P病例—父母核心三人家系（表1）。所有研究對象均屬于中國西部地區漢族人群，且符合先天性NSCL/P診斷標準，不合并其他先天畸形或先天性疾病。簽訂書面知情同意書后，采集患者及其父母外周靜脈血5～6 mL。另外再同期收集納入研究的268例患者的母親填寫《唇腭裂流行病學研究問卷表》，舍棄無效資料，將有效資料數據錄入資料庫，對PDGF-C基因的SNPs位點基因型和環境暴露因素（孕婦吸煙/被動吸煙、葉酸補充史、環境有害氣體長期吸入史）之間是否存在交互作用進行條件Logistic回歸分析。本研究及研究過程中所需操作均獲得倫理委員會的批準。

表1 NSCL/P分類情況表Tab 1 Classif i cation of NSCL/P

1.2 SNPs位點的選擇和基因分型

PDGF-C基因位于染色體4q32區域，在International HapMap Project數據庫中查詢PDGF-C基因的CHB（Han Chinese in Beijing，China）部分典型SNPs圖，選擇位于PDGF-C基因結構中分布較遠且雜合度大于20%的2個靶向SNPs位點（表2）。PDGF-C基因分型采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）—限制性酶切片段長度多態法和直接測序法，均委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。所選SNPs位點信息及PCR引物序列見表3。

表2 PDGF-C基因選用的SNPs情況Tab 2 Selected SNPs of PDGF-C gene

1.3 數據統計分析

采用SPSS 20軟件對患者及雙親rs4691383位點和rs7667857位點進行哈溫平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium）檢驗。采用Haploview軟件對rs4691383位點和rs7667857位點進行連鎖不平衡 （linkage disequilibrium，LD）分析，并采用Family Based Association Test（FBAT）1.7.2軟件對父母至少一方為雜合子的家庭進行傳遞不平衡檢驗（transmission disequilibrium test，TDT）和單倍型關聯分析（haplotype association），檢測等位基因在父母和患者之間的傳遞情況。對PDGF-C基因和環境暴露因素之間是否存在交互作用進行條件Logistic回歸分析。

2 結果

2.1 哈溫平衡檢驗

rs4691383位點和rs7667857位點雙親的基因型頻率測量值和期望值無統計學差異（P＞0.05），符合哈溫平衡，具有群體代表性。

表3 PDGF-C SNPs位點PCR引物序列、溫度及產物片段長度Tab 3 PCR primers, temperature and product fragment length of the SNPs at PDGF-C

2.2 LD分析

利用FBAT軟件進行LD分析，結果表明：D'=0.05，說明rs4691383與rs7667857位點間發生過重組；r2=0.012，說明rs4691383與rs7667857位點具有統計學意義。

2.3 TDT分析

將雙親中含有雜合子的家系進行TDT分析（表4），在NSCLP、NSCPO、NSCL/P組內，rs4691383和rs7667857兩個位點傳遞的A等位基因頻率與未傳遞的A等位基因頻率均存在統計學差異（P＜0.05），傳遞與未傳遞的G等位基因頻率也均存在統計學差異（P＜0.05）。

相對危險度分析顯示：在NSCL/P的發生過程中，rs4691383位點的G等位基因存在傳遞不足，反之，A等位基因存在過度傳遞；rs7667857位點的G等位基 因存在過度傳遞，反之，A等位基因存在傳遞不足。

表4 PDGF-C基因rs4691383和rs4691383位點TDT分析Tab 4 Allelic TDT results for rs4691383 and rs4691383 SNPs in PDGF-C

2.4 單倍型關聯分析

rs4691383和rs7667858位點共可構建4種單倍型，利用FBAT軟件關聯分析各單倍型與NSCL/P的相關性（表5）。其中A-A（P＜0.05）、A-G（P＜0.01）和G-A（P＜0.01）3種單倍型具有統計學意義。在所有rs4691383參與構成的具有統計學意義的單倍型中，均包含rs4691383位點的A等位基因。

2.5 孕早期環境危險因素的條件Logistic回歸分析

孕婦吸煙/被動吸煙、葉酸補充史、環境有害氣體長期吸入史和PDGF-C基因型的條件Logistic回歸分析結果見表6～8。結果表明，孕婦吸煙/被動吸煙史、葉酸補充史、環境有害氣體長期吸入史這3個環境暴露因素與PDGF-C基因的SNPs位點基因型之間均不存在交互作用。

表5 SNPs的單倍型分析Tab 5 Haplotype analyze of SNPs

表6 吸煙/被動吸煙和PDGF-C基因型條件Logistic回歸分析Tab 6 The results of conditional Logistic regression analysis between smoking/passive smoking and the PDGF-C genotype

3 討論

NSCL/P具有顯著的遺傳異質性，由易感基因與孕期環境因素聯合致病。PDGF-C基因（157.89～158.12 Mb）位于4q32.1，屬于PDGF的家族成員之一[20]。Choi等[14]研究發現，位于PDGF-C調節區域的rs28999109位點的T等位基因與中國人群的CL/P發生之間存在正相關，揭示了PDGF-C基因與NSCL/P發病密切相關。SHH、PDGF、WINT等基因介導的信號通路中斷可導致顱面部發育異常。Hoch等[21]研究表明，PDGF基因的信號通路在腭板吸引神經嵴細胞進入形成腭的過程中起重要作用，提示PDGF-C基因敲除小鼠出現腭部發育不良是由于神經嵴細胞遷移進入上腭板架障礙所致。在斑馬魚實驗中microRNA Mirn140在腭發育過程中負調控PDGF信號通路，為PDGF基因如何導致腭裂形成提供了一種機制，也揭示了PDGF-C基因可作為NSCL/P的候選基因[22]。條件性PDGF-C基因敲除小鼠研究[23]表明，PDGF-C基因表達的缺失會導致胚胎缺陷，包括腭部融合障礙，因此提出PDGF-C基因在腭發育中的作用突出。研究[15]表明，PDGF-A和PDGF-C信號均通過PDGFRA調控顱面結構、神經管和中胚層器官的發育，其異常會出現口面裂、脊柱裂、腎皮質間質缺乏以及骨骼血管缺陷等畸形，更加證實了PDGF-C基因與NSCL/P發生密切相關。

表7 葉酸補充史和PDGF-C基因型條件Logistic回歸分析Tab 7 The results of conditional Logistic regression analysis between the history of folic acid supplementation and the PDGF-C genotype

表8 環境有害氣體長期吸入史和PDGF-C基因型條件Logistic回歸分析Tab 8 The results of conditional Logistic regression analysis between the long history of inhalation of environmental harm ful gases and the PDGF-C genotype

本研究意在探索PDGF-C基因SNPs位點與中國西部漢族人群NSCL/P發生的相關性。在International HapMap Project數據庫中選擇位于PDGF-C基因結構中分布較遠的2個SNPs位點（rs4691383位點和rs7667857），且雜合度大于20%（rs4691383為0.463，rs7667857為0.273），優于其他SNPs位點，十分具有代表性。本研究患者雙親的基因型頻率分布符合哈溫平衡，具有群體代表性。TDT結果表明，rs4691383位點A等位基因存在過度傳遞，是NSCL/P發生的危險因素；rs7667857位點G等位基因過度傳遞，是NSCL/P發生的危險因素；A等位基因傳遞不足，是保護性因素。本研究證實PDGF-C基因rs4691383和rs7667857位點與中國西部人群NSCL/P發生具有相關性。LD分析結果顯示，D'值＜1，說明2個SNPs位點間發生過重組，存在一定程度的連鎖；r2＜1，說明rs4691383與rs7667857位點具有統計學意義。通過FBAT軟件對2個靶向SNPs位點進行單倍型分析，發現rs4691383位點的A等位基因所構成的單倍型與NSCL/P有較強的關聯性。

遺傳因素和環境因素在NSCL/P的發生過程中均發揮著重要作用。本研究對孕期環境因素（有/無吸煙或被動吸煙，有/無葉酸服用，有/無環境有害氣體長期吸入）在NSCL/P發生中與PDGF-C基因型的相互作用進行了統計分析。但未發現在NSCL/P的發生過程中PDGF-C基因的2個SNPs位點的基因型與3種環境暴露因素之間存在交互作用。目前國內外對環境因素與NSCL/P發病的相關性有一定研究。Dien等[24]研究表明，孕期母親被動吸煙與口面裂發生無關，飲用含咖啡因飲料的母親會增加唇裂患兒的風險，葉酸或多種維生素的充分補充可預防口面裂的發生。Jia等[25]研究發現，補充維生素和葉酸可降低CL/P的發生風險；母親被動吸煙可增加CL/P的發生風險；加強產前護理，減少環境暴露，可降低CL/P的發生風險。Yin等[26]收集了1 710例唇腭裂患者和956例健康新生兒的《唇腭裂患者流行病學調查》，研究證明孕期母親吸煙、母親被動吸煙及母親飲酒與唇腭裂發生密切相關，分別比對照組患病風險增加了8.776、2.780和2.985倍。另外，本研究納入的“有或無環境有害氣體長期吸入”這一因素，是指母親生活或工作環境中經常接觸脂肪族酸或醛、乙醇醚、三氯乙烯、殺蟲劑等有機溶劑或其他污染，其與NSCL/P的相關性也有類似的研究。Zhao等[27]研究發現，在妊娠前3個月，母親暴露于空氣污染（O3，CO，SO2，PM2.5和PM10）會增加子代口面裂的風險。Chevrier[28]研究表明，母親孕期職業接觸有機溶劑混合物，會增加后代發生NSCL/P的風險。Aschengrau等[29]研究表明，在妊娠前3個月接觸四氯乙烯污染的飲用水（＞40 μg·L-1）的母親生下患有脊柱裂、唇裂、腭裂和尿道下裂等畸形嬰兒的風險增加。以上研究說明，環境因素在NSCL/P發生中作用顯著。但本研究尚未發現在NSCL/P的發生過程中PDGF-C基因的兩個SNPs位點的基因型與3種環境暴露因素之間存在交互作用。

綜上，本研究發現中國西部人群PDGF-C基因單核苷酸多態性與NSCL/P的發生存在相關性，這在一定程度上可以完善中國西部人群唇腭裂發生遺傳數據庫。雖然環境暴露因素與PDGF-C基因的2個SNPs位點的基因型之間的交互作用尚未得到證實，但環境暴露因素單獨對NSCL/P發生的作用仍不容忽視。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。