白色念珠菌對口腔黏膜疾病惡性轉化作用的研究進展

廖敏 程磊 周學東 任彪

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院牙體牙髓病科，成都 610041

口腔癌是指發生在口腔和口咽部的惡性腫瘤，是頭頸部最常見的惡性腫瘤，也是全球十大最流行的惡性病損之一[1-2]。按組織病理學分類，口腔癌可分為上皮來源的口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）、肉瘤、淋巴瘤、黑色素瘤等，其中OSCC最為常見，所占比例超過90%[3]。流行病學資料顯示，口腔癌的5年生存率僅為60%，男性的發病率和死亡率均高于女性[4-6]。口腔癌的發生與多種危險因素有關，包括吸煙、飲酒、感染、咀嚼檳榔、理化刺激等[7-8]。感染在腫瘤發生發展中扮演了重要角色，據統計，全球大約1/5的惡性腫瘤與感染有關[9-10]。口腔是一個復雜的微生態系，口腔內定植的微生物數量龐大，種類繁多，容易引發多種感染。許多研究發現，口腔微生物感染與口腔癌存在密切關系，如人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）病毒[7]、EB（Epstein-Barr）病毒[11]、牙齦卟啉單胞菌等[12]，而關于真菌的研究相對較少，但真菌在其中扮演的重要角色卻不可忽視。

白色念珠菌（Candida albicans，C. albicans）是口腔中最常見的機會性致病真菌，當局部微環境改變或者機體抵抗力下降時，白色念珠菌會轉變為致病菌，引起黏膜念珠菌病或系統性念珠菌病。腫瘤患者大多接受放化療，因此處于免疫抑制的狀態，較非腫瘤患者患念珠菌病的概率更高。然而，越來越多的研究發現，念珠菌病不僅僅只是患腫瘤后的易感病，白色念珠菌也可能在腫瘤的發生發展中起到能動作用，尤其是口腔癌。

早在1969年，就有學者提出了白色念珠菌與口腔黏膜癌變存在密切關系，長期的黏膜念珠菌感染可能會增加口腔黏膜癌變的風險[13-14]，大量學者對其進行了相關的研究，探究其中的機制，取得了一定的進展。因此，本文就白色念珠菌感染與口腔黏膜疾病惡性轉化的關系，及白色念珠菌可能作用機制作一綜述。

1 白色念珠菌感染與口腔黏膜癌變的關系

1.1 白色念珠菌與慢性增生性念珠菌病

白色念珠菌感染引起的口腔黏膜念珠菌病按照臨床表現可以分為四型，分別為假膜型念珠菌病、急性紅斑型念珠菌病、慢性紅斑型念珠菌病和慢性增殖型念珠菌病（chronic hyperplastic candidosis，CHC）[15]。其中，CHC癌變概率最高[16]，其臨床表現為口腔黏膜表面黏附性的、不能被拭去的增厚的白色斑塊，其主要特征為念珠菌菌絲侵入上皮。據報道，若未能及時有效地治療，10%的CHC會發展成為OSCC[17-18]。

由于CHC主要是按照其臨床表現命名，因此，該病的原始病因目前尚不確定[17,19]。可能最初是由念珠菌感染所形成的增生性病變，也可能是黏膜先形成白斑，然后繼發念珠菌感染。從后一個角度來看，該病也被稱為“念珠菌性白斑”（candidal leukoplakia，CL）。白斑是一種癌變概率較高的癌前病變，但有研究[8,20]發現，伴有念珠菌感染的白斑比未感染念珠菌的白斑其癌變概率更高。從這個方面可見，白色念珠菌在口腔黏膜癌變過程中起到了一定的作用。

1.2 白色念珠菌與遺傳病相關口腔黏膜疾病

另一種證明白色念珠菌感染與口腔癌存在密切關系的疾病是自身免疫性多內分泌腺病、念珠菌感染和外胚層營養不良綜合征（autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy，APECED），一種多發于芬蘭的隱性遺傳病，幾乎所有患者都有長期的慢性黏膜念珠菌病，且容易在早年癌變[21]。Rautemaa等[22]曾報道了6例APECED患者，在平均年齡37歲就被確診為口腔和食管鱗狀細胞癌，其中5例都曾長期患有慢性念珠菌病，據此可以推測，白色念珠菌感染可能是癌變的重要促進因素。不過，這些報道涉及的病例數量都相對較少，仍然需要繼續追蹤調查，提供更多的相關病例和研究。

1.3 白色念珠菌與口腔癌

臨床研究[23]表明，在念珠菌感染的人群中，腫瘤的發生率顯著高于無念珠菌感染的人群，包括頭頸部腫瘤、血液惡性腫瘤等。據報道，74%的口腔癌患者唾液中可檢出念珠菌，分離的念珠菌中，白色念珠菌所占比例最高，為84%[24-25]。在口腔癌患者黏膜表面和組織活檢中，白色念珠菌的檢出率和載荷量明顯也高于非口腔癌患者[26-27]。進一步的比較發現，口腔癌患者與非口腔癌患者口腔黏膜表面分離的白色念珠菌菌株25SrDNA基因型存在明顯差異，在口腔癌患者分離得到的白色念珠菌主要是基因型A型（450 bp），而非口腔癌患者口腔中主要是基因型B型（840 bp）[26]。這些證據提示，口腔黏膜癌變與白色念珠菌的異常定植、侵襲有關，特定基因型的菌株在其中可能起到了重要作用，而這種特定基因型是如何影響白色念珠菌的毒力及致癌能力的，還有待進一步研究。且目前的這些相關研究多是描述性研究，也可能是患者在患有口腔癌之后，造成了口腔微環境或者機體免疫狀態等的改變，使得口腔癌患者白色念珠菌感染與非口腔癌患者之間出現這種差異。因此，還需要一些前瞻性的研究，提供論證強度更高的證據。

1.4 白色念珠菌促進黏膜癌變

在流行病學研究的基礎上，為進一步驗證白色念珠菌是否能促進黏膜癌變，有學者進行了小鼠體內實驗。他們用硝基喹啉（4 nitroquinoline 1-oxide，4NQO）作為誘導上皮惡變的引發劑，預處理小鼠，再用白色念珠菌感染，觀察白色念珠菌的促癌效應。結果發現，僅用4NQO處理，未引起明顯的上皮病損；僅用白色念珠菌處理也只引起上皮過度增生；但4NQO預處理后加入白色念珠菌感染，口腔黏膜出現上皮不典型增生，細胞周期相關蛋白Ki-67和P16的表達顯著增高[28]，即在4NQO誘導上皮腫瘤生成的小鼠中，白色念珠菌能促進上皮癌變。這些結果表明口腔癌的發生是多因素共同作用所致，白色念珠菌感染是其中重要的誘因[28]。

2 白色念珠菌可能的促癌機制

2.1 破壞上皮屏障

白色念珠菌感染上皮過程包括黏附到上皮表面，繼而侵襲、損傷上皮。首先，白色念珠菌通過其表面的黏附素黏附到上皮細胞表面，主要包括凝集素樣序列蛋白（agglutinin-like sequence，Als）、菌絲壁蛋白（hyphal wall protein，Hwp）等[29-30]。成功黏附后，白色念珠菌可通過誘導上皮細胞內吞、主動地穿透兩種機制侵襲上皮、突破上皮屏障。誘導內吞是指白色念珠菌表面的Als蛋白與上皮細胞表面E-鈣黏蛋白結合，刺激上皮細胞產生偽足樣結構，像一張網一樣捕獲真菌，將其內吞進入上皮細胞[31]。另外，白色念珠菌能分泌特異性的蛋白酶，降解基底膜和細胞外基質成分，實現主動穿透上皮屏障[17]。如分泌性天冬氨酸蛋白酶（secreted aspartyl proteinases，Sap），能降解上皮結合處的黏附蛋白，即E-鈣黏蛋白[32-33]。P?rn?nen等[34]發現，白色念珠菌分泌的蛋白酶，能降解基底膜的層粘連蛋白332，破壞上皮連接及基底膜的完整性。最近研究[35]發現，白色念珠菌菌絲相能分泌一種真菌肽毒素，即Candidalysin，由ECE1基因編碼，能夠損傷上皮細胞膜，誘導上皮細胞炎性反應，產生白細胞介素（interleukin，IL）-1α、粒細胞集落刺激因子（gra nulocyte colonystimulating factor，G-CSF）等炎性因子，釋放乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）。腫瘤的生長和侵襲涉及腫瘤細胞和基質細胞的多種反應，白色念珠菌的這種水解、破壞作用，不僅有利于白色念珠菌對上皮組織的侵襲，也有利于腫瘤細胞的轉移和擴散[17]。

2.2 產生致癌物質

關于白色念珠菌致癌機制最為廣泛接受的假說就是產生致癌物質，包括亞硝胺（nitrosamines）、乙醛（acetaldehyde）等。這些致癌物質可能直接作用于口腔上皮，或者與其他物質相互反應、共同作用，誘導上皮癌變，促進腫瘤發展[36]。

2.2.1 亞硝胺 白色念珠菌具有亞硝化作用，能夠代謝前體物質N-芐基甲胺（N-benzylmethylamine，BMA），產生甲基芐基亞硝胺（N-nitrosobenzylmet hylamine，NBMA）。而這種前體物質BMA廣泛存在于食物中，如胡蘿卜、沙拉、鯡魚油、凍干咖啡等，濃度高達0.2～20 μg·kg-1。不同生物型的白色念珠菌亞硝化的能力不同，106菌量代謝足量BMA能產生0～1.2 μg·kg-1NBMA，其中，惡變程度較高的口腔黏膜病損分離的菌株亞硝化能力最強，主要包括051、147、151、153、157、353生物型[37]。產生的NBMA能與DNA結合形成加合物，誘導基因突變，促進小鼠形成食管和口腔鱗狀細胞癌，因此NBMA常用作誘變劑，建立動物食管癌模型[17,38-39]。Krogh等[37]認為，白色念珠菌不僅能產生亞硝胺作用于黏膜表面，還能侵入上皮組織深層，可能將唾液中一些亞硝胺的前體物質轉移到上皮深層，產生的亞硝胺在組織中沉積，產生持久的致癌作用。

最近，Sanjaya等[40]提出，白色念珠菌的這一機制的直接致癌作用尚存在爭議。上皮的完整性破壞、吸煙等危險因素存在會增加白色念珠菌的毒性。因此，白色念珠菌的亞硝化作用結合其他危險因素共同作用，促進口腔癌的發生發展，或許更具說服力。

2.2.2 乙醛 從正常人、口腔潛在惡性病損、OSCC患者口腔分離白色念珠菌菌株，分別代謝11 mmol·L-1乙醇（與80 kg體重男性飲3杯酒后唾液中乙醇含量相當），均能產生大量的乙醛（＞40 μmol·L-1），而OSCC患者口腔分離菌株產生乙醛的能力最強[21,41-42]。研究[42]表明，40～100 μmol·L-1的乙醛就有明顯的致癌性，一方面，乙醛與細胞的蛋白、DNA結合形成穩定的加合物，使其結構和功能發生異常改變，這種加合物能干擾正常的DNA復制，誘導點突變，還能影響DNA修復和胞嘧啶甲基化相關的酶，導致細胞周期打亂，促進原癌基因的激活，導致腫瘤生成。另一方面，乙醛還能損傷線粒體，增加活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生，從而促進DNA的損傷，促進腫瘤發生發展[36,43-44]。

口腔內乙醛的累積，是微生物代謝、機體的行為習慣和遺傳背景等共同作用的結果。一般情況下，機體主要通過乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）代謝、清除乙醛，編碼該酶的正常基因為ALDH2*1，但40%的亞洲人體內是ALDH2*2基因。ALDH2*2基因所編碼產生的ALDH活性極低，導致體內乙醛含量增加，增高了患上消化道腫瘤的概率[44]。此外，Gainza-Cirauqui等[41]研究發現，口腔潛在惡性病損患者中，有吸煙、飲酒習慣的患者口腔白色念珠菌產生乙醛的能力明顯高于不吸煙、飲酒的患者，據此推測，吸煙、飲酒可能會增加白色念珠菌產生乙醛的能力，這也就有助于解釋為什么吸煙、飲酒是口腔黏膜惡變的最重要的危險因素。然而，吸煙、飲酒如何提高白色念珠菌產生乙醛能力，還需要進一步研究。

2.3 誘導慢性炎癥反應

早在19世紀就有學者[45]提出了炎癥與腫瘤存在密切聯系，并進行了一系列的研究。從流行病學角度來看，腫瘤多發生在慢性炎癥的部位，而長期服用非甾體類抗炎藥能降低患某些腫瘤的風險和腫瘤造成的死亡率[46]。從分子生物學的角度來看，機體遺傳學的改變，能導致炎癥、異常增生和癌變；炎癥可以改變局部微環境，促進腫瘤發生發展[47]。這些炎性產物一定程度上有助于募集免疫細胞、清除感染物質，同時，也是維持、促進腫瘤進展和惡變表型所必須的，如促進腫瘤組織的重建、血管生成、轉移、抑制抗腫瘤的先天性免疫等[36,48]。白色念珠菌感染口腔上皮，引發的炎癥反應、產生的炎性產物，在口腔癌的發生發展中起到了一定的作用。目前與口腔癌相關的炎性因子主要有前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）。

2.3.1 PGE2白色念珠菌感染宮頸癌細胞系HeLa細胞，能被其表面的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLRs）識別，包括TLR2、TLR4，繼而激活細胞內蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、P38MAPK通路和核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路，增加炎性產物環氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）的產生和PGE2的合成[49]。現有研究[50]表明，白色念珠菌感染口腔上皮細胞也能上調PGE2的表達，而作者并未對其中的機制進行闡述，由于不同的上皮細胞表面的受體及其對白色念珠菌的敏感性可能不同，白色念珠菌上調口腔上皮細胞PGE2表達是否也有相似的機制，還有待進一步研究驗證。目前研究已證實，PGE2在腫瘤的發生發展中起到了重要的促進作用。Yang等[51]發現，PGE2能與口腔癌細胞表面的PGE受體（EP1）結合，激活蛋白激酶δ（proteinkinase Cδ，PKCδ）、c-Src、c-Jun、激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）信號通路，上調細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1）的表達，促進口腔癌細胞的遷移。而對一些其他腫瘤的研究表明，PGE2也能產生一些其他的促癌效應，如反式激活表皮生長因子受體，促進細胞遷移與侵襲，抑制細胞凋亡[52]；上調血管內皮生長因子、成纖維細胞生長因子的表達，促進腫瘤血管生成[53]；PGE2還能抑制樹突狀細胞分化、T細胞增殖、自然殺傷細胞和巨噬細胞的抗腫瘤活性等，產生免疫抑制的效應[54]。而PGE2對于口腔癌是否也有上述類似的促進機制，還有待進一步研究證實。

2.3.2 MMPs Claveau等[55]研究發現，白色念珠菌感染人重組口腔上皮模型，使上皮細胞MMP9表達明顯增高，2型基質金屬蛋白酶組織抑制劑（type 2 matrix metalloproteinase tissue inhibitors，TIMP2）表達明顯降低。MMP9能降解基底膜的Ⅳ型膠原，破壞基底膜完整性，有助于白色念珠菌的播散，以及腫瘤細胞的轉移和侵襲，降低患者生存率[56]。有趣的是，作者還發現，白色念珠菌感染人重組口腔上皮細胞后，MMP2僅基因轉錄上調，但MMP2蛋白卻明顯降低，為何會出現這種相反的結果及其中的機制，目前還不清楚。

2.4 免疫反應

白色念珠菌促進口腔癌發生發展可能與T細胞免疫反應及IL-17的作用有關。白色念珠菌感染口腔黏膜主要通過刺激nTh17細胞（又稱TCRαβ細胞）和TCRγδ細胞產生IL-17[57]。最近有研究[35,58]表明，白色念珠菌刺激nTh17細胞的關鍵毒力因子是一種真菌肽毒素，即candidalysin，能直接攻擊口腔上皮細胞，引發IL-1的釋放；還能特異性的刺激nTh17細胞增殖，促進產生IL-17，這種刺激nTh17的增殖效應有賴于IL-1α/β相關的通路。同時，產生的IL-17又能與念珠菌素協同作用，促進IL-1產生，形成一種自我強化的前饋環路，增強機體的免疫反應。產生的IL-17對腫瘤有雙重作用，一方面，IL-17能通過誘導IL-6、IL-12的產生，增強細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）的反應，產生抑制腫瘤的作用[59]；另一方面，IL-17能夠促進口腔癌細胞增殖、侵襲和遷移，與患者預后差密切相關[60]（圖1）。最近，Xiang等[61]發現IL-17能促進卵巢癌CD133+腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）的自我更新能力，促進腫瘤形成，主要與NF-kB、P38MAPK通路活化有關。此外，IL-17刺激胃癌靜止的CSCs，能夠使其表現出上皮間充質轉化的表型，即E-鈣黏蛋白表達降低，N鈣黏蛋白、波形蛋白等表達增高，腫瘤形成和轉移能力增強，這可能與IL-17促進細胞內STAT3信號的磷酸化有關[51]。IL-17還能夠刺激成纖維細胞上調血管內皮生長因子的表達，促進炎性部位和腫瘤的血管生成[62]。據此可以推測，靶向控制IL-17及相關的信號分子，可能會成為一種新的腫瘤治療策略。然而目前關于IL-17與口腔癌的研究相對較少，是否也能通過控制白色念珠菌感染、IL-17的產生，從而一定程度上控制口腔癌的發生發展，也有待進一步研究。

3 展望

腫瘤是多因素共同作用的疾病，而口腔是一個復雜、動態變化的環境，口腔癌與感染、宿主免疫、飲食、口腔衛生等多種因素有關。白色念珠菌在一定程度上能夠促進口腔癌，也可能是機體自身狀態和其他外部因素的協同作用的結果。例如，白色念珠菌能代謝乙醇產生乙醛，長期飲酒不僅會給白色念珠菌提供代謝產物，會使白色念珠菌產生乙醛的能力發生適應性增強，共同增加患癌風險[39]。有學者認為，白色念珠菌在口腔癌中的直接作用尚存在爭議，更可能是一種間接的促進作用，結合吸煙會提高促癌作用[40]。

圖1 白色念珠菌作用口腔癌的可能機制Fig 1 Probable mechanisms of C. albicans infection to oral cancer

目前關于口腔癌與病毒、細菌的研究較多，而關于白色念珠菌的研究還相對較少[17]，其中多是流行病學分析和描述性研究，關于分子生物學的研究還比較缺乏，許多假設還有待進一步驗證。白色念珠菌感染刺激T細胞分泌IL-17，IL-17能促進口腔癌細胞增殖、侵襲和遷移，但是IL-17如何作用于口腔癌細胞的具體機制尚未闡明，而IL-17在其他腫瘤中的作用有更深入的研究，或許可以作為研究其與口腔癌的相互作用提供參考[60]。此外，白色念珠菌是否存在其他可能促癌機制，以及控制白色念珠菌是否會影響口腔癌的發生，尚不清楚。因此，還需要進一步研究，來更好地認識白色念珠菌與口腔癌的關系，為口腔癌的臨床防治工作提供依據。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。