利用微生物生物轉化大黃的研究進展

文 雅，于雪榮，王泓午，郝 征，邢竹青

（天津中醫藥大學健康科學與工程學院，天津 301617）

傳統的中藥提取主要是水煎或醇提法，但隨著現代發酵釀造工藝的不斷發展，利用微生物對中藥進行生物轉化成為一種新的趨勢。微生物在發酵中藥時，可以產生一些能夠分解轉化物質能力的微生物，并能夠產生一些次生代謝產物，最終擴大用藥范圍，增強藥物的療效[1]。

現代微生物學研究表明，大黃能增加腸蠕動，保護腸道黏膜功能[2]；大黃有抗感染作用，對許多革蘭氏陽性和陰性細菌，如脆弱類桿菌、單形類桿菌等均有一定的抑制作用[3]；大黃對流感病毒和假狂犬病毒的滅活作用也十分明顯，且對艾滋病病毒、霍亂毒素也有一定的抑制作用[4]；大黃有利膽和健胃作用；此外，還有調節免疫、清除氧自由基、致泄、保肝利膽、保護心腦血管、改善微循環、抗腫瘤等作用[4]。目前，已有很多報道表明，大黃可以有效抑制食源性致病菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌），并能應用于食品保藏和農業生產中[5-7]。

本文將從大黃創新發酵技術優勢、大黃發酵技術菌株種類和研究現狀、發酵技術目前的局限性幾個方面進行闡述，為今后發酵大黃的規模化生產提供指導和參考。

1 大黃傳統炮制的不足與大黃創新發酵技術的優勢

隨著中藥市場需求的增大，傳統炮制加工方法帶來的有效成分利用率低，藥效不穩定，加工過程繁瑣等問題也日益凸顯。大黃的傳統炮制方法也正存在上述問題（見表1）。

表1 傳統大黃炮制的不良影響Table 1 Adverse effects of traditional rhubarb processing

大黃生用瀉下作用劇烈，易引起腹痛、惡心等胃腸道反應。因此，在實際治療過程中，常經不同的煎煮、加輔料炮制成各種炮制品，從而緩解大黃的瀉下作用及對胃腸道的不良反應。然而，大黃煎煮過程愈長瀉下作用愈弱，煎煮大黃不僅引起結合蒽醌的水解，還會導致游離蒽醌的降解，甚至還存在蒽醌類成分間的化學轉化[8-9]。國外報道長期應用大黃中蒽醌類成分可致肝、腎損害以及潛在的致癌風險[10-13]。這些問題都給大黃臨床應用過程提出了很高的要求。所以，進一步完善并創新大黃制劑的提取精制工藝，以減少蒽醌類成分的損失，對中藥大黃的高效利用及推廣有重要的現實意義[14]。

隨著現代發酵技術的飛速發展，利用微生物進行發酵加工，較傳統炮制方法已有明顯優勢，主要體現在：（1）有利于實現中藥發酵技術的標準化，專業化。在繼承傳統的中藥發酵技術的基礎上，利用現代微生態學的成果知識，結合現代微生物工程形成的中藥制藥新技術，完成一些常規炮制方法難以實現的反應，較大幅度地改變藥性，提高療效，降低毒副作用[21]。（2）有利于在中藥創新研究領域開辟新的研究方向。近年來對于中藥藥用功能的研究越來越深入，但卻缺乏制藥過程的創新和進步，此舉極大的阻礙了其實際臨床應用中的穩定性。通過采取更為經濟、安全、無污染的中藥發酵技術對中藥進行加工，開辟了其炮制過程的新角度和新思路。（3）有利于篩選具有我國自主知識產權的生物轉化菌株。我國目前利用微生物發酵法進行中藥生物轉化還處于剛剛起步的階段，發酵菌研究多集中于真菌[22]，大多使用常見的益生菌株進行發酵。所以，為了取得更好的生物轉化效果，需要不斷搜集菌株的資源，為形成我國具有自主知識產權的中藥生物轉化菌株庫奠定堅實基礎[23]。

2 中藥大黃發酵技術國內外研究現狀

國內應用的發酵工藝主要采用固體發酵[24]。在適宜的培養基上培養，收集微生物自身的生長代謝和生命活動產生次生代謝產物。但利用中草藥發酵生產藥物的研究起步較晚，20世紀80年代的研究主要集中在真菌類自身發酵，多為單一發酵產生次生代謝，如靈芝菌絲體、冬蟲夏草菌絲體發酵等[25]。現代利用中草藥發酵的研究已從單味藥擴展到復方研究且取得顯著成果，楊海龍等[26]借助真菌靈芝產生的豐富酶系通過對薏苡仁的轉化，使薏苡仁的主要成分發生了變化。“康復靈”為抗癌驗方，主要成分有靈芝發酵菌、黨參、麥冬、豬苓、薏苡仁、淮山藥等，經生物發酵轉化后多數樣品具有抑制小鼠肉瘤生長的作用[27]。有研究使用酵母粉發酵大黃粗粉，發酵后，結合型蒽醌含量降低，游離型蒽醌含量增加6倍左右[15]。段維和[28]使用9株真菌對大黃進行發酵改性研究，發現經疣狀毛癬菌發酵后抗菌活性明顯增強，游離型蒽醌含量增加3倍左右。劉洋等[29]使用多種益生菌組合（干酪乳桿菌、糞腸球菌、產朊假絲酵母）制成菌劑后，應用于發酵復方中草藥（王不留行和益母草），發現可溶性總黃酮、總生物堿、粗多糖和總皂苷含量明顯提高。類似使用益生菌發酵大黃也有報道，明顯增強對于大腸桿菌的抑制作用[30]。

近年來，發酵藥材越來越受到研究者重視，在韓國和臺灣的學術界引起研究熱潮。有研究發現，蛹蟲草菌發酵的五味子藥渣能夠提高仔豬的免疫功能[31-32]。陳茂彬[33]從根際土壤篩選到一株能轉化藜蒿黃酮類物質的菌株，根據形態及顯微結構特征可以初步鑒定為芽孢桿菌屬菌株，轉化后的總黃酮量是轉化前的7.56倍。國外對于中藥發酵的研究主要集中在酶和食品工程領域，在食品分析檢測過程中，以酶作為分析試劑，在基礎研究方法、檢驗儀器和設備、酶試劑的來源和儲存、標準分析方法的制定以及應用范圍上均領先于國內[33]。如對肉桂的研究，肉桂的菌絲和子實體在預防和治療肝病方面具有潛在價值，有望被開發成保健食品或新藥。而發酵和栽培技術的應用使這種藥用蘑菇的菌絲和子實體更容易獲得[34]。又如日本的納豆，用芽孢桿菌發酵大豆，利用芽孢桿菌中酶系豐富且能增加維生素K含量的特點，消除小腸內致病菌，其提取物也具有明顯的抗癌活性和降壓作用[35]。也有用真菌曲霉接種到大黃中，然后測定發酵和未發酵的大黃提取物的化學成分以及抗氧化、抗菌、抗癌的活性的相關報道[36]。

目前，大黃發酵的研究還處于初級階段，已有的國內相關研究報道較多，主要研究目標集中在發酵菌株的篩選及蒽醌類型的轉化；國外研究相對較少，主要致力于有效物質結構和含量的轉化分析[37-38]。由于應用現代科技技術對其展開科學研究時間較短，系統、成熟的利用微生物轉化技術還鮮見報道。現有成果距離形成可供實際規模化生產尚有較大差距，有必要借鑒上述成功的經驗，進行進一步深化的研究探討。

3 大黃發酵技術菌株種類

3.1 酵母菌作為發酵菌株

酵母菌作為發酵工業中的常用菌之一，在發酵大黃的研究中也被報道有很好的生物轉化效果。發酵后，使大黃中的結合型蒽醌有效地轉化為游離型蒽醌，從而降低大黃的峻瀉作用，進而降低對胃腸道或其他的不良反應。

高潔等[39]通過實驗證實，利用酵母菌發酵大黃，在一定條件下，游離型蒽醌的轉化率可達到42.369%。戴萬生等[15]研究發現，大黃經酒精酵母、面包酵母分別發酵后，總蒽醌含量略有降低，分別為生品的97.8%、98.2%，與有關文獻[40]比較，發現傳統的炮制方法均普遍使大黃總蒽醌含量明顯降低，說明發酵法有利于保存大黃總蒽醌，發酵法優于傳統的炮制方法。同時，大黃經酒精酵母、面包酵母分別發酵后，結合型蒽醌含量降低，分別為生品的52%、48%，而游離型蒽醌含量大大增加，分別為生品的594%、648%。說明發酵法也能使大黃結合型蒽醌有效的轉化為游離型蒽醌。馬超等[41]通過實驗篩選到酵母菌株KM12，經26S rRNA分子鑒定為馬克思科魯維酵母（Kluyveromyces marxianus），用菌株KM12發酵法炮制中藥大黃，能夠使結合型蒽醌分解或轉化成游離型蒽醌，從而緩和大黃的峻烈瀉下作用。

3.2 霉菌和蕈菌作為發酵菌株

呂平[42]優化了菌株素赭曲霉（Aspergillus ochraceus）LP-0301，通過鈉離子注入獲得大黃素高產菌株，并且優化了發酵條件，使其最終產率達1.453 mg/L，比出發菌株提高2.96倍。因此由菌株LP-0301發酵產大黃素的含量較藥用植物高，有很好的開發價值。

鄔吉野[43]通過建立槐耳大黃雙向發酵體系，明顯提高了大黃的轉化。研究結果顯示，經槐耳雙向發酵后，結合型蒽醌含量降低明顯，游離型蒽醌含量增加明顯，說明發酵法能使大黃結合型蒽醌轉化為游離型蒽醌，從而緩和大黃峻瀉作用，且雙向發酵后槐耳大黃菌質體系有新成分產生，并有一定的抑制腫瘤效果。

3.3 益生菌作為發酵菌株

由于益生菌在腸道功能改善研究中的突出表現，也有學者探討了利用不同益生菌發酵大黃后的產物變化。韓佳慧等[30]通過利用益生菌N-14對大黃進行發酵，發酵大黃與水煎液大黃相比，對大腸桿菌的抑制作用大大增強。王惠蕓等[44]在雙歧桿菌對12種中藥的發酵與抗菌活性檢測分析中發現：12種中藥通過雙歧桿菌的發酵作用，使得抗菌活性發生不同程度的變化。但大黃發酵前以及發酵之后對于細菌的抑制作用并沒有非常明顯的變化。

3.4 內源菌群發酵

利用內源菌群相對來說簡單易得，因此很多學者也對此進行了摸索。王楠[45]利用植物大黃地上葉片部分中存在的一種內生真菌-葉點霉菌為發酵菌株，R7269大黃酸為標準品，對實驗條件多次優化后，測得葉點霉發酵液中總蒽醌類物質的平均得率可達23.96 mg/g。于志偉等[46]以一株分離自高原掌葉大黃的腐皮鐮刀菌R13為研究對象，通過調節初始pH以及添加丙酸和丙二酸，可以促進該菌生產大黃素，最終大黃素產量可達3.908 mg/L，有望成為大黃素高產菌株。

3.5 外源菌株發酵

目前，用于大黃發酵的菌株也有來自其他植物或動物資源，經過生物轉化后的活性物質可用于抗氧化或改變腸道菌群結構。

楊玉紅等[47]以自主篩選的軟棗獼猴桃內生真菌Z2為發酵菌株，研究發現經發酵后的大黃可生產具有多功能抗氧化活性的蒽醌，蒽醌類物質質量濃度為100 μg/mL時，對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力為72.27%，對超氧陰離子的清除能力為13.33%，對烷基自由基的清除能力高達76.75%。王瑞風等[48]研究認為，大黃酸經小鼠本身的菌群作用后，可增加糖尿病小鼠腸道中的擬桿菌，同時減少硬壁菌，使擬桿菌與硬壁菌的比例升高，而已有研究表明，擬桿菌比例的下降可以導致代謝紊亂[49]。

4 大黃發酵技術的局限性

就大黃本身來說，我國尚缺乏生物轉化大黃的深入研究。雖然目前已有多種微生物種類應用于大黃的發酵條件摸索，但存在實際應用生產轉化率不高的現實問題。發酵后的大黃所含成分及藥理作用的影響，也有待進一步研究發展。雖然我國的發酵技術歷史悠久，但中藥菌株發酵技術仍處于起步階段，存在諸多亟待解決的問題，例如：單一菌種與混合菌種之間的選擇，單味中藥與復方中藥之間的權衡，體內發酵與體外發酵的比較，生物制品和創新藥物的定位問題等[50]。對中草藥的成分進行生物轉化，進而確定轉化前后藥效的變化，需要微生物學、中醫學、中藥學、分析化學、藥理學等多學科參與。同樣，存在于發酵大黃開發中也有一系列的疑問需要解開：微生物發酵體系構成如何、發酵時是否改變了大黃的藥效成分，微生物代謝是否產生了新的成分，發酵后的大黃產物對于腸道疾病的作用效果如何？存在何種作用機制？這些無疑是一個個巨大的挑戰。

5 展望

利用微生物進行食品行業中的釀造和品質改良的傳統由來已久，也已取得非常突出成果，但是利用發酵技術轉化中藥成分還處于初級階段，擁有巨大的發展潛力。發酵工程和酶工程已被列為中醫藥領域創新轉化的重要項目之一，其中發展傳統中醫藥，是實現中藥現代化、具有高科技水平的新技術[30]。有學者呼吁將單味中藥、具有類似或協同作用的中藥進行發酵，以達到產生新化合物、增強功效或者降低單一藥物不良作用的效果。中藥經發酵、生物轉化后，其有效成分能被充分分離、提取；經生物轉化更具有生物活性，在中藥現代化過程中具有重要地位。由此，在大黃的有效成分轉化過程中，借助中藥發酵技術，研究大黃發酵現狀的意義得以凸顯。應用現代生物技術大規模工業化提取中草藥的有效生物活性成分，發展具有中國特色的生物技術醫藥工業具有廣闊的前景。