大豆多肽的分離純化及其體外降血脂功能研究

肖聰麗，李 理*，陳 敏

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510641；2.中新國際聯合研究院，廣東廣州 510000）

高血脂癥是指血脂水平過高，主要表現為膽固醇和甘油三酯水平過高。高血脂癥常常會并發糖尿病[1]、動脈粥樣硬化[2]等疾病，嚴重危害人體健康。據美國國家衛生統計中心的數據分析，自1999-2012年以來，高膽固醇血癥的患病率從1999-2000年的3%增加到2011-2012年的6.3%[3]，同時，高血脂癥也越來越趨于年輕化[4]。目前，針對高血脂癥的治療多為化學藥物，具有一定的毒副作用[5]，越來越多的人將研究的重點轉移到天然活性產物中來[6-7]。大豆蛋白是一種營養價值較高的植物性蛋白質，其必需氨基酸組成符合聯合國糧農組織（Food and agriculture organization，FAO）/世界衛生組織（world health organization，WHO）標準模式，是良好的蛋白質補充劑。大豆蛋白經過物理或化學處理后，得到的大豆多肽不僅具有溶解度高、穩定性好等優良的加工特性[8]，同時還具有多種生理功能活性，包括抗氧化[9-11]、降血壓[12-13]、降血脂[14-15]、抗癌[16-17]等，極具研究和開發價值。

目前，國內外對大豆多肽降血脂活性及其作用機制的研究日趨深入，高夢笛[18]利用斑馬魚高血脂模型來研究大豆多肽Lunasin的降血脂活性，推測其機理主要是通過參與膽固醇代謝來調節血脂，進而降低血脂水平。LAMMI C等[14，19]研究發現，從大豆球蛋白中分離出的三個多肽（IAVPGEVA，IAVPTGVA和LPYP）能夠通過激活低密度脂蛋白受體-固醇調節元件結合蛋白2（LDLR-SREBP2）途徑來抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCoAR）的活性并調節膽固醇代謝，從而增加人肝癌細胞（HepG2）攝取低密度脂蛋白的能力。本研究通過HepG2肝癌細胞構建高膽固醇細胞模型，以大豆蛋白為對照組，分析大豆多肽對HepG2細胞內總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high densitylipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的影響，從而評價大豆多肽的體外降血脂活性。同時，采用凝膠過濾層析法和納米技術-高效液相色譜-串聯質譜（nano-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，Nano-HPLC-MS/MS）技術對大豆多肽的組成和結構進一步分析、鑒定，旨在為降血脂大豆多肽的開發和應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆蛋白（蛋白含量91.90%）：臨沂山松生物制品有限公司；大豆多肽（經復合蛋白酶酶解制備而成，蛋白含量為91.25%）：中慈保健品生物有限公司；乙腈（色譜純）：龐博生物有限公司；橄欖油：益海糧油工業有限公司；胰脂肪酶（酶活力為500 U/mg）、曲拉通X-100（分析純）、膽固醇（純度≥99.00%）：美國Sigma公司；最小必需培養基（minimal essential medium，MEM）、總膽固醇試劑盒、甘油三脂試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒：美侖生物有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JW-3021離心機：安徽嘉文儀器裝備有限公司；HWS-12恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；YX-18HDD高壓滅菌鍋：江陰濱江醫療設備有限公司；HF細胞培養箱：力新儀器（上海）有限公司；RT-6000酶標儀：深圳雷杜生命科學股份有限公司；EASY-nano-LC 1200 Q Exactive plus質譜儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；Acclam PepMap C18分析柱（75 μm×15 cm）：上海希言科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT細胞增殖及毒性實驗

利用四甲基偶氮唑藍（methylthiazalyltetrazolium，MTT）比色法檢測不同濃度的大豆蛋白、大豆多肽對HepG2細胞增殖的影響，以此確定最適的樣品濃度。取對數期的HepG2細胞（含有1%雙抗＋10%胎牛血清的MEM培養基在37 ℃、5%CO2的二氧化碳養箱中培養），加入0.25%的胰酶消化1～2 min，計數，接種于96孔板中，每孔加100 μL，使其細胞數為5 000個/孔，于37 ℃、5%CO2條件下靜置培養24 h，每孔更換100 μL新的培養基，添加不同質量濃度（1.25 μg/mL、12.50 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL、200.00μg/mL、500.00μg/mL、1000.00μg/mL、5000.00μg/mL）[20]的樣品，作用24 h后，棄去上清液，隨后添加100 μL的MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h后，添加一定量的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解液，待底部的結晶紫完全溶解后，將96孔板置于酶標儀上，于波長490 nm處測定其吸光度值，細胞存活率的計算公式如下：

1.3.2 高膽固醇細胞造模實驗

待肝癌細胞HepG2鋪滿細胞瓶底的80%～90%時，用胰酶消化、懸浮、計數，按照終濃度為2×105個/mL接種于96孔板中，在二氧化碳培養箱中靜置培養24～48 h，當細胞單層長滿孔板底部時，換成無血清培養基，并在培養基中加入不同質量濃度（5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25 μg/mL）的膽固醇溶液，作用24 h后，棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）清洗3遍后，用胰酶消化，完全培養基終止消化。將細胞懸浮液轉入離心管中，于1 500 r/min離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，離心，棄上清，用PBS懸浮細胞，細胞破碎儀破碎細胞后，按照試劑盒說明，測定各組細胞內的膽固醇濃度。

1.3.3 大豆多肽對HepG2細胞中TG、TC的影響

待細胞培養瓶中細胞長滿瓶底至80%～90%時，用胰酶消化、離心、稀釋至一定濃度后，將細胞接種于96孔板中，加入一定濃度的膽固醇于完全培養基中，每孔加樣量為2.5mL，作用一段時間后，添加不同質量濃度（10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）的樣品，培養24 h，隨后吸去上清液，用胰酶消化，離心，PBS清洗3遍，添加250 μL的1%Triton X-100，隨后于4 ℃冰浴裂解30～40 min。采用TG、TC試劑盒檢測其含量。

1.3.4 大豆多肽對HepG2細胞中LDL-C、HDL-C和SOD的影響

待細胞培養瓶中細胞長滿瓶底至80%～90%時，用胰酶消化、離心、稀釋至一定濃度后，將細胞接種于96孔板中，加入一定濃度的膽固醇于完全培養基中，每孔加樣量為2.5mL，作用一段時間后，添加不同質量濃度（10μg/mL、50μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL）的樣品，培養24 h，隨后吸去上清液，用胰酶消化，離心，PBS清洗三遍，添加250 μL的1%Triton X-100，隨后于4 ℃冰浴裂解30～40 min。采用LDL-C、HDL-C和SOD試劑盒檢測其含量。

1.3.5 體外胰脂肪酶活性的測定

在50 mL的三角瓶中加入4 mL的橄欖油和5 mL pH值為7.5的PBS緩沖液，混勻至乳液狀后，置于40 ℃保溫5 min，加入1 mL 5 mg/mL的胰脂肪酶，其中空白組加入1 mL的胰脂肪酶，實驗組加入1 mL的胰脂肪酶和1 mL的待測樣品，混勻后在40 ℃準確反應30 min，以15 mL的體積分數為95%乙醇終止反應后，在溶液中加入2～3滴1%的酚酞指示劑，用0.025 mol/L的NaOH滴定至淡紅色出現，并且在30 s內不褪色，記錄消耗的NaOH溶液體積，胰脂肪酶活力的計算公式如下[21]：

式中：VA為樣品組消耗NaOH滴定液的體積，mL；VB為空白組消耗NaOH滴定液的體積，mL；M為NaOH滴定液的濃度，mol/L；W為胰脂肪酶的取樣量，g；T為反應時間，min。

1.3.6 大豆多肽的分子質量分布

采用國標GB/T22492—2008《大豆肽粉》中的檢測方法，稍加修改。具體方法如下：采用高效凝膠過濾色譜法進行檢測，其中色譜柱為TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）（內徑）的凝膠柱，流動相∶乙腈∶水∶三氟乙酸=200∶800∶1（V/V），流速為0.5 mL/min，檢測波長為220 nm[22]。

1.3.7 凝膠過濾層析

采用葡聚糖凝膠SephadexG15作為填料，裝填至60mm×2.5 mm的玻璃層析柱中，平衡2～3個柱體積后上樣，以去離子水為洗脫液，洗脫流速為1 mL/min，檢測波長為220 nm，用自動收集器收集各組分，將屬于同一峰的組分合并、濃縮并凍干，待后續備用[23]。

1.3.8 Nano-HPLC-MS/MS

將樣品復溶于水后經由配備在線納噴離子源的HPLCMS/MS分析。流動相：0.1%甲酸-水（A）和0.1%甲酸-乙腈（B），上樣3 μL樣品，以線性梯度分離，0～60 min，8%～40%B。柱流量控制在200 nL/min，柱溫為40 ℃，電噴霧電壓2 kV。

1.3.9 數據分析

串聯質譜圖經過PEAKSStudioX軟件分析。實驗數據采用SPSS 23.0進行分析，每組數據均為3次測定的平均值，結果以“平均值±標準差”表示，采用Duncan法進行單因素顯著性差異分析，采用t檢驗進行組間顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 大豆多肽的分子質量分布

通過凝膠過濾色譜法對大豆多肽樣品的分子質量分布進行分析，結果見表1。由表1可知，大豆多肽中分子質量在190～451 Da范圍內為其主要成分，占68.95%，其次是分子質量在451～1 452 Da范圍內的組分，占18.80%，分子質量＞6 500 Da的組分最少，僅占0.94%。其中，分子質量＜1 500 Da的組分占比＞87%，這表明該大豆多肽主要由小分子肽構成。INOUE N等[24]從大豆蛋白酶解液中分離出3個二肽（KA、VK和SY），進一步研究發現，KA、VK和SY均可以顯著降低HepG2細胞中甘油三酯的合成量（P＜0.05），其中，SY能夠有效抑制載脂蛋白-B的分泌，具有一定的降血脂活性。NAGAOKA S等[25]研究發現，大豆多肽（WAWWMY）的膽酸結合能力與降血脂藥物消膽胺相當，能夠顯著降低大鼠血清、肝臟和腸道的膽固醇含量（P＜0.05）。

表1 大豆多肽的分子質量分布Table 1 Molecular weight distribution of soybean peptides

2.2 大豆多肽的體外降血脂實驗

2.2.1 MTT實驗[26]

本實驗考察了8個濃度梯度的樣品對HepG2肝癌細胞的抑制作用，結果見圖1。由圖1可知，在1.25～5 000 μg/mL的質量濃度范圍內，HepG2細胞的存活率均＞99.00%，這表明在該濃度范圍內大豆多肽和大豆蛋白對HepG2細胞不具有細胞毒性作用，且不具有顯著性差異（P＞0.05），在此濃度范圍內可以進行后續的實驗。

圖1 大豆蛋白和大豆多肽對HepG2肝癌細胞的存活影響Fig.1 Effect of soybean protein and soybean peptides on the survival of HepG2 liver cancer cells

2.2.2 高膽固醇細胞造模實驗

圖2 不同質量濃度的膽固醇對總膽固醇含量的影響Fig.2 Effect of different concentrations of cholesterol on total cholesterol content

以HepG2肝癌細胞來構建高膽固醇細胞模型，其結果見圖2。由圖2可知，當膽固醇質量濃度＜20 μg/mL時，膽固醇的含量隨著膽固醇濃度的增加而增加，膽固醇質量濃度＜20 μg/mL時，膽固醇的含量不再顯著增加（P＞0.05），膽固醇質量濃度為20 μg/mL時，對應的膽固醇含量為7.41 mmol/L，高于正常水平時的膽固醇含量，這表明當膽固醇質量濃度為20 μg/mL時，高膽固醇細胞模型構建成功，因此，將此膽固醇質量濃度20 μg/mL作為造模濃度。

2.2.3 大豆多肽對HepG2細胞中TG和TC含量的影響

圖3 不同質量濃度的大豆蛋白和大豆多肽對HepG2細胞中TG（a）及TC（b）含量的影響Fig.3 Effect of different concentrations of soybean protein and soybean peptides on TG (a) and TC (b) contents

以大豆蛋白為對照組，通過添加不同質量濃度（10μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）的大豆多肽，研究其對HepG2細胞中甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）含量的影響。細胞中TG含量的變化如圖3a所示，在10～100 μg/mL的質量濃度范圍內，細胞中TG的含量隨著大豆多肽和大豆蛋白濃度的升高而降低，當質量濃度達到100 μg/mL時，大豆蛋白和大豆多肽對應的TG濃度分別為9.8μmol/g和4.6μmol/g，與10μg/mL時對應的TG濃度相比，分別降低了810%和880%。這表明，大豆蛋白和大豆多肽均能夠在一定程度上抑制細胞中TG的產生，與大豆蛋白對照組相比，大豆多肽在濃度10μg/mL、100 μg/mL時對TG具有顯著性降低作用（P＜0.05）。細胞中TC含量的變化如圖3b所示，在10～100 μg/mL的質量濃度范圍內，大豆蛋白和大豆多肽對細胞中TC含量的影響與TG基本一致，均與樣品濃度呈負相關。100 μg/mL的大豆多肽和大豆蛋白對應的TC濃度分別為2.9μmol/g和2.1 μmol/g，與10 μg/mL的樣品濃度對應的TC濃度相比（65.5 μmol/g和78.9 μmol/g），顯著降低（P＜0.05）。綜合以上分析，大豆多肽能夠在一定程度上抑制細胞中TG和TC的產生，且大豆多肽對TG的抑制作用稍強于對照組大豆蛋白。

2.2.4 大豆多肽對HepG2細胞中LDL-C和HDL-C含量的影響[27]

以大豆蛋白為對照組，通過添加不同質量濃度（10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL）的大豆多肽，研究其對HepG2細胞中LDL-C和HDL-C含量的影響，結果見圖4。

圖4 不同質量濃度的大豆蛋白和大豆多肽對HepG2細胞中LDL-C（a）及HDL-C（b）含量的影響Fig.4 Effect of different concentrations of soybean protein and soybean peptides on LDL-C (a) and HDL-C (b)production in HepG2 cells

由圖4a可知，細胞中LDL-C的含量與大豆蛋白和大豆多肽的濃度呈負相關。10 μg/mL的大豆蛋白和大豆多肽對應的LDL-C濃度分別為255.3 μmol/g和90.2 μmol/g，而當質量濃度達到500 μg/mL時，對應細胞中LDL-C濃度分別為55.8 μmol/g和2.7 μmol/g，對比降低了460%和3 340%。在相同的樣品質量濃度下，大豆多肽對應的細胞中LDL-C濃度要顯著低于大豆蛋白。這表明大豆多肽對細胞中LDL-C的抑制作用顯著高于大豆蛋白對照組（P＜0.05）。由圖4b可知，隨著大豆蛋白和大豆多肽濃度的升高，細胞中HDL-C的含量隨之升高。當質量濃度為500 μg/mL時，大豆蛋白和大豆多肽對應的細胞中HDL-C濃度分別為54.0 μmol/g和69.2 μmol/g，與10 μg/mL時相比，分別增長了24.4%和37.3%。與對照組大豆蛋白相比，大豆多肽對細胞中HDL-C的產生具有更強的促進作用。綜合以上分析，大豆多肽能夠抑制細胞中LDL-C的產生并促進HDL-C的產生，且對HDL-C的促進作用顯著高于對照組大豆蛋白（P＜0.05）。

2.2.5 大豆多肽對HepG2細胞中SOD活力的影響

以大豆蛋白為對照組，通過添加不同質量濃度（10μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL）的大豆多肽，研究其對HepG2細胞中超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響，結果見圖5。由圖5可知，隨著大豆蛋白和大豆多肽質量濃度的增加，細胞中SOD活力隨之增加。當樣品質量濃度由10 μg/mL增加至500 μg/mL時，大豆多肽的SOD活力由0.634 U/g增加到0.987 U/g，增幅為35.71%。與對照組大豆蛋白相比，在相同質量濃度下，大豆多肽對細胞中SOD活力的促進作用極顯著增強（P＜0.01）。綜上所述，大豆多肽能夠在一定程度上促進細胞中SOD活力，且大豆多肽的促進作用顯著高于對照組大豆蛋白（P＜0.05）。

圖5 不同濃度的大豆蛋白和大豆多肽對HepG2細胞中SOD活力的影響Fig.5 Effect of different concentrations of soybean protein and soybean peptides on SOD activity in HepG2 cells

2.3 大豆多肽的分離純化及鑒定

2.3.1 凝膠過濾層析法

采用Sephadex G-15凝膠柱對大豆多肽進行分離純化，其結果見圖6。

圖6 大豆多肽分離純化凝膠層析圖Fig.6 Gel chromatogram of soybean peptide separation and purification

由圖6可知，經過G-15葡聚糖凝膠色譜分離后得到三個主要的多肽峰，分別為E1、E2、E3，根據凝膠層析的原理可知，組分E3為分子量最小的組分，隨后將三個組分收集后濃縮、凍干，留待備用。

將上述三個組分用去離子水配制成質量濃度10 mg/mL的溶液，分析各個組分的胰脂肪酶抑制率，結果見圖7。由圖7可知，純化后的組分E2、E3與未純化的大豆多肽相比，其抑制胰脂肪酶抑制率顯著性提高（P＜0.05），而與組分E1相比則沒有顯著性差異，其中組分E3的胰脂肪酶抑制率最高，達22.33%，因此選擇純化后的組分E3用于下一步的純化和鑒定。

圖7 不同組分對應的胰脂肪酶抑制率Fig.7 Pancreatic lipase inhibition rate of different components

2.3.2 Nano-HPLC-MS/MS

采用Nano-HPLC-MS/MS技術對大豆多肽組分E3進行進一步的分析與鑒定，根據二級質譜中母離子和碎片離子的特性，在數據庫中篩選出匹配度最高的多肽序列，該方法為數據庫比對法。對于數據庫中未匹配到的肽段，可利用碎片離子的質量差，得到對應的氨基酸殘基，采用從頭測序法進行進一步的分析。通過以上兩種方法，可以對大豆多肽進行全面地篩選。

（1）數據庫比對結果分析

通過數據庫搜庫比對匹配后得到的大豆肽段有6744條，最小的大豆多肽為七肽，最大的大豆多肽為四十五肽，分子質量分布在500～5 000 Da，電荷數在1～7之間，大豆多肽最大的峰面積為4.21×109。其中多肽百分含量最高的是九肽，為11.09%，共有748個；其次是十一肽，百分含量為10.97%，共有740個，第三是十二肽；百分含量為9.83%，共有663個；二十肽到四十五肽共有335個，百分含量為4.97%，其中LIDSVLDVVRK百分含量最高，其分子質量為1 255.75 Da，占比為0.31%。

（2）從頭測序法結果分析

利用從頭測序法鑒定出10 540種多肽，含有2～39個氨基酸，其中十五肽以下的游離肽占比為92.89%，十六肽到三十九肽的數量為749個、十五肽226個、十四肽331，十三肽389個、十二肽460個、十一肽443個、十肽540個、九肽552、八肽690個、七肽973個、六肽1 514個、五肽1 603個、四肽1 439、三肽630個、二肽為1個，含量排在前三位的分別是五肽、六肽和四肽，其中五肽的百分含量最高，占多肽總含量的15.21%。

氨基酸局部置信度（amino acid local confidence，ACL）為從頭測序數據結果的置信度，通常認為結果較為可信的，其ACL＞80%，非常可信時ACL＞95%，對此將從頭測序結果中ACL＞95%、百分含量最高的4個多肽結果統計在表2中，結果顯示，這4個肽中包括1個五肽、2個六肽和1個七肽，對其多肽序列分別為LLDTN、FLEHAF、DFGKFF和LVGLKLY，對應的分子質量分別為574.30 Da、762.37 Da、759.36 Da、804.51 Da。

表2 從頭測序法分析的游離肽Table 2 The free peptides using de novo sequencing methods

3 結論

結果表明，大豆多肽的分子質量＜1 500 Da的組分占比＞87%，主要由小分子肽構成。通過HepG2肝癌細胞構建高膽固醇細胞模型，以大豆蛋白為對照組，分析大豆多肽對細胞內TC、TG、HDL-C、LDL-C和SOD活力的影響。大豆多肽對細胞中TG、TC、LDL-C的產生具有一定的抑制作用，對細胞中HDL-C的產生和SOD活力具有促進作用，且大豆多肽對TG、LDL的抑制作用及對HDL-C和SOD活力的促進作用均強于對照組大豆蛋白，具有良好的體外降血脂活性。通過凝膠過濾層析法和Nano-HPLC-MS/MS技術對大豆多肽進行純化和鑒定，最終篩選出5個多肽，分別為LLDTN、FLEHAF、DFGKFF、LVGLKLY和LIDSVLDVVRK，對應的分子質量為574.30 Da、762.37 Da、759.36 Da、804.51 Da和1 255.75 Da。本研究表明，大豆多肽具有良好的體外降血脂活性，同時對大豆多肽進行了分離和結構鑒定，這為降血脂大豆多肽的開發和工業化應用提供了新思路和理論基礎。