四川麩醋發酵過程中醋醅理化指標及有機酸變化分析

于 華 ，唐 姣，趙佳麗，梅小慶，周 鑫，陳夢媛，張 紅

（1.四川工業科技學院食品學院，四川德陽 618500；2.四川老川東食品有限公司，四川成都 610500）

食醋是我國飲食生活中必不可少的一種酸性調味品[1]，它的發明、發展和傳播是對人類飲食文化的一大貢獻[2]。在中國有“四大名醋”的說法，即四川麩醋、鎮江香醋、山西老陳醋以及福建紅曲醋[3]。作為四大名醋之一的四川麩醋，其主要特點是以麥麩為釀造主要原料，藥曲為糖化發酵劑，采用糖化、酒化、醋化同池進行的生料固態開放式天然多菌種混合發酵工藝，發酵結束后其醋醅需要經過2～3年時間的曬制[4]，其風味及功能性物質的形成主要是通過各種微生物的代謝作用共同實現的，在發酵過程中微生物將原料中的淀粉、蛋白質等物質降解為還原糖、氨基酸等，同時還分泌大量的揮發性物質（醇類、酯類、醛類、酮類等）、有機酸（乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸等）和功能性物質（川穹嗪、黃酮等）等[5]。這些物質的共同存在賦予了四川麩醋特有的風味和良好的保健功能。由于四川麩醋釀造生產完全依賴于自然接種和發酵，因此存在生產周期長、產品質量不穩定以及產量低等問題，要進行有效的生產控制和工藝改造，就必須對現行傳統工藝進行分析研究[6]。

食醋中有機酸的種類與含量既決定著其酸味質量，又與產品特色密切相關[1]。有機酸是構成食醋風味的主要成分，影響著食醋的滋味、口感，因此對食醋中有機酸的組成與含量的分析有利于評價食醋品質[7-8]。

目前，關于四川麩醋的研究多為功能菌株的篩選及產品風味物質的分析，對于發酵過程中理化指標及有機酸變化規律的系統研究鮮有報道，本研究對四川某麩醋釀造廠的醋醅跟蹤采樣，研究其發酵過程中水分含量、pH值、總酸、揮發酸、不揮發酸、氨基酸態氮、還原糖、淀粉含量等理化指標和有機酸組成與含量的變化規律，以期對生產控制和工藝改造提供較為系統的實驗研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

麩醋醋醅樣品均采集自四川某著名傳統麩醋廠，該廠生產的麩醋是采用最傳統的麩醋釀造方式發酵，是傳統四川麩醋生產的典型代表。本實驗隨機選取3個發酵正常的池子進行取樣，分別取發酵0、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d共6個階段的醋醅樣品，-20 ℃保存。

1.1.2 試劑

石油醚、無水乙醇、鹽酸、乙酸鉛、硫酸鈉、葡萄糖、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、磷酸、（NH4）2HPO4、甲醛、NaOH、硫酸鋅、亞甲基藍（均為分析純）、甲醇（色譜純）：成都市科龍化工試劑廠；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；乳酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、草酸、富馬酸、丙酮酸、蘋果酸、琥珀酸標準品（純度＞98%）：天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

CP214電子天平、Starter 2C pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學儀器有限公司；TW-2000W可控調溫電爐：成都市永信電器廠；DZTW電子調溫電熱套：北京市永光明醫療儀器有限公司；78HW-1恒溫磁力攪拌器：金壇市醫療儀器廠；Agilent 1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫公司；Gemini 5u C18110A色譜柱（250 nm×4.6 mm）：美國菲羅門公司；Sep-Pak C18Cartridge固相萃取小柱：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 麩醋發酵過程中醋醅理化指標的測定

水分含量[1]：準確稱取2.0 g醋醅樣品于稱量皿中，105 ℃恒溫烘干至恒質量，稱質量并計算醋醅中的水分含量。

pH值[5]：稱取100 g醋醅樣品于500 mL燒杯中，加入300 mL蒸餾水，并用保鮮膜將燒杯口封住，浸泡3 h，期間不斷搖動，保證酸充分溶解于水中。而后用雙層濾紙過濾，濾液待用。采用pH計直接測定濾液的pH值。

總酸含量[9]：取濾液按照GB/T 5009.41—2003《食醋衛生標準的分析方法》中電位滴定法測定。先計算出濾液的總酸含量，再轉化成干醅的總酸含量。

不揮發酸含量（以乳酸計）[10]：取濾液按照GB 18187—2000《釀造食醋》測定。不揮發酸含量計算公式如下：

揮發酸含量（以乙酸計）[6，11]=總酸-不揮發酸×0.06/0.09。

氨基酸態氮含量[12]：取濾液按照GB/T 5009.39—2003《醬油衛生標準的分析方法》中甲醛值法測定。

還原糖含量[13]：參照GB/T 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》中的直接滴定法（斐林試劑法）測定。

淀粉含量[14]：參照GB/T 5009.9—2016《食品安全國家標準食品中淀粉的測定》中的酸水解法測定。

1.3.2 麩醋發酵過程中醋醅有機酸組成分析

醋醅樣品預處理：稱取30.0 g醋醅樣品于250 mL燒杯中，加90 mL超純水，用保鮮膜將燒杯口封住，浸泡3 h，期間不斷搖動。用雙層濾紙過濾，濾液待用。吸取25 mL濾液于100 mL容量瓶中，加入5 mL 30%硫酸鋅溶液和5 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，定容，靜置30 min后雙層濾紙過濾，用0.22 μm微孔濾膜過濾，再經Sep-Pak C18固相萃取小柱，流出液供HPLC檢測[15-17]。

HPLC條件：Gemini5uC18110A色譜柱（250nm×4.6mm），以5%甲醇-95%0.5%（NH4）2HPO4（用H3PO4調節pH值為2.7）為流動相，流速0.5 mL/min，柱溫35℃，紫外檢測波長210 nm，進樣量20 μL[17-18]。

定性定量：配制乙酸、富馬酸、乳酸、蘋果酸、草酸、丙酮酸、檸檬酸、酒石酸和琥珀酸的混合標準溶液，其質量濃度分別為15.83 mg/mL、0.30 mg/mL、15.33 mg/mL、6.07 mg/mL、0.80mg/mL、1.28mg/mL、8.50mg/mL、4.00mg/mL、6.18mg/mL。分別取0、10 mL、12.5 mL、25 mL、50 mL的混合標準品溶液于100 mL容量瓶中，定容，混勻，得到不同質量濃度的標準品溶液。采用HPLC進行檢測，以峰面積（y）為縱坐標，質量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線。以保留時間和樣品加標定性，再利用標準曲線回歸方程計算樣品中有機酸的含量。

1.3.3 數據處理

采用Excel 2016、Origin 8.5、SPSS 22.0軟件對實驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 麩醋發酵過程中醋醅理化指標的變化

2.1.1 醋醅中水分含量的變化

醋醅中水分含量的高低直接影響著微生物的生長繁殖和代謝活動[19]，其在麩醋發酵過程中的變化見圖1。

由圖1可知，醋醅中水分含量隨發酵的進行呈現出先升后降的趨勢，在發酵前3 d，水分含量逐漸升高；在發酵3 d時達到最高，為63.90%；第4～15天，前期下降明顯，后期下降緩慢，水分含量均維持在60%以上，總體波動不大。分析原因可能是發酵前期微生物代謝旺盛，產生風味物質、生成水、放熱，使麩醋醋醅溫度逐漸升高，水分呈增長的趨勢；發酵后期，溫度的升高使得水分被散發，同時由于麩皮具有較強的吸水能力導致其水分含量下降緩慢。

圖1 麩醋發酵過程中醋醅中水分含量的變化Fig.1 Changes of water contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

2.1.2 醋醅中總酸含量和pH值的變化

食醋中影響其酸味的主要因素是pH和總酸。總酸是各種酸性物質的總量，其含量是發酵過程中的一個重要理化指標，是檢驗發酵是否完成的標志[20]。pH所反映的H+濃度決定著食醋酸味的強弱[6]。醋醅中總酸含量和pH值的變化見圖2。

圖2 麩醋發酵過程中醋醅中總酸含量和pH值的變化Fig.2 Changes of total acid contents and pH value in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

由圖2可知，醋醅在發酵過程中總酸含量一直處于增長的趨勢，前期增長迅速，后期較為緩慢。分析原因可能是在發酵前期，醋醅適宜產酸微生物的生長繁殖和代謝活動，生成大量的有機酸，使總酸含量迅速升高；到發酵后期，由于營養物質的消耗和有機酸的積累，使釀造環境處于高酸度、低營養狀態，從而導致醋酸菌、乳酸菌等產酸菌代謝緩慢，總酸含量增長緩慢。總酸含量不斷增加，pH值逐漸減小，但變化不明顯，始終維持在4.0～4.4之間，說明四川麩醋醋醅在發酵過程中形成了一個緩沖體系，pH值始終處于動態平衡。

2.1.3 醋醅中揮發酸和不揮發酸含量的變化

食醋中有機酸包括揮發酸和不揮發酸，其中揮發酸主要是乙酸，不揮發酸主要是乳酸[11]。醋醅中揮發酸和不揮發酸含量的變化見圖3。

圖3 麩醋發酵過程中醋醅中揮發酸與不揮發酸含量的變化Fig.3 Changes of non-volatile acid and volatile acid contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

在發酵過程中，揮發酸與不揮發酸含量均呈現逐漸上升的趨勢。在發酵0～9 d，不揮發酸的含量高于揮發酸的含量；在發酵9～15 d，揮發酸的含量高于不揮發酸的含量，分析原因可能是由于在發酵前期乳酸菌大量繁殖，代謝產生乳酸等不揮發酸，發酵后期醋酸菌利用前期酵母菌產生的乙醇代謝生成乙酸。不揮發酸含量在發酵前期上升迅速，后期變得緩慢，可能是因為發酵初期未翻醅，醋醅處于厭氧環境，有利于乳酸菌發酵產生乳酸，后期天天翻醅，空氣進入使乳酸菌代謝減慢，產物生成降低。揮發酸含量一直呈現明顯上升的趨勢，是由于醋醅發酵是糖化、酒化、醋化同時進行的，醋酸菌邊繁殖邊利用酵母產生的乙醇代謝生成乙酸，在營養充足，每天翻醅供氧的條件下，揮發酸含量快速上升。

2.1.4 醋醅中氨基酸態氮含量的變化

氨基酸態氮是食醋重要的組成部分，反映食醋中氨基酸及小肽總體水平，其含量的高低影響著食醋的質量等級和整體風味[21]。醋醅中氨基酸態氮含量的變化見圖4。

圖4 麩醋發酵過程中醋醅中氨基酸態氮含量的變化Fig.4 Changes of amino acid nitrogen contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

由圖4可知，隨著發酵時間的延長氨基酸態氮含量呈現逐漸上升的趨勢，且在發酵前期升高的快，后期相對緩慢。氨基酸態氮的來源主要是蛋白質水解生成蛋白胨、肽、氨基酸等。發酵前期快速增加，可能與藥曲中酸性蛋白酶水解有關；發酵后期微生物數量減少、蛋白酶活力下降，同時，氨基酸態氮參與麩醋中風味物質的形成，使得氨基酸態氮含量上升緩慢[22]。

2.1.5 醋醅中還原糖含量的變化

還原糖作為一種重要的碳水化合物，在發酵過程主要以葡萄糖和麥芽糖的形式存在，為微生物的代謝活動提供碳源和能源，同時也是形成食醋風味的前提物質[11]。醋醅中還原糖含量的變化見圖5。

圖5 麩醋發酵過程中醋醅中還原糖含量的變化Fig.5 Changes of reducing sugar contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

由圖5可知，醋醅中還原糖含量在發酵前期不斷升高，后期逐漸降低。分析原因可能是發酵初期，微生物的大量繁殖代謝產生淀粉水解酶，原料中的淀粉被分解成葡萄糖、麥芽糖等還原糖，從而使醋醅中還原糖含量上升；發酵后期，微生物代謝活動利用大量的還原糖，使其含量降低，此外，還原糖還參與食醋風味及食醋顏色的形成。

2.1.6 醋醅中淀粉含量的變化

在食醋發酵過程中，淀粉作為其酒化階段的物質基礎，經過液化、糖化作用，轉化成糖類等物質，為微生物的生長繁殖、代謝活動提供物質基礎和能量來源，使得發酵得以順利的進行，同時其含量的變化能反映發酵的進度，對食醋釀造生產工藝具有指導作用[23]。醋醅中淀粉含量的變化見圖6。

由圖6可知，淀粉含量在醋醅發酵過程中呈現持續下降的趨勢。分析原因可能是在發酵前期，微生物代謝活動產生各種液化酶、糖化酶等將淀粉迅速降解為還原糖，使其含量下降很快；此后，醋醅發酵以酒化作用為主，淀粉水解酶誘導作用降低、糖化力減弱，導致淀粉含量下降變得緩慢；發酵后期，由于酸的大量積累，使各類酶的活性受到抑制，同時，微生物的生長也受到抑制，淀粉含量變得緩慢。

圖6 麩醋發酵過程中醋醅中淀粉含量的變化Fig.6 Changes of starch contents in fermented vinegar grains during bran vinegar fermentation process

2.2 麩醋發酵過程中醋醅中有機酸分析

2.2.1 有機酸標品的保留時間及標準曲線

通過HPLC對混合有機酸標準溶液進行測定，各有機酸標品的保留時間、回歸方程、相關系數及線性范圍見表1。

表1 各有機酸的標準曲線Table 1 Standard curves of each organic acid

由表1可知，9種有機酸的標準曲線的相關系數R2均＞0.99，說明線性關系良好，可用于各有機酸的定量。

2.2.2 麩醋發酵過程中醋醅有機酸組成及含量

采用高效液相色譜法對四川麩醋發酵階段的醋醅樣品中的有機酸組成及含量進行分析，結果見表2。

表2 四川麩醋發酵過程中醋醅有機酸組成及含量分析Table 2 Analysis of organic acid compositions and contents in fermented vinegar grains during fermentation process of Sichuan bran vinegar

由表2可知，從四川麩醋發酵過程中共檢測出8種有機酸，分別為草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。其中丙酮酸含量由發酵初始階段的0.11 g/100 g干醅上升至發酵結束時的0.38 g/100 g干醅，提高了250%；乙酸含量由1.91 g/100 g干醅上升至5.65 g/100 g干醅，提高了200%；琥珀酸含量從0.21 g/100 g干醅上升至0.44 g/100 g干醅，提高了110%；乳酸含量從2.94 g/100 g干醅上升至4.26 g/100 g干醅，提高了40%；除此之外，其余各種有機酸均隨著發酵的進行其含量也有不同程度的增長，但增長較為緩慢。

2.2.3 麩醋發酵過程中醋醅有機酸的變化規律

麩醋發酵過程中含量最高的有機酸為乳酸和乙酸，其總量占有機酸總含量的80%以上，因此對醋醅的總有機酸以及兩種主要有機酸（乙酸、乳酸）含量的變化進行分析，結果見圖7。

圖7 四川麩醋發酵過程中醋醅中總有機酸、乙酸及乳酸含量的變化Fig.7 Changes of the total organic acids,acetic acid and lactic acid contents in fermented vinegar grains during fermentation process of Sichuan bran vinegar

由圖7可知，麩醋發酵過程中，醋醅中有機酸總量呈增長趨勢，從發酵初始階段的（5.76±0.56）g/100 g干醅增長至發酵結束時的（11.55±0.42）g/100 g干醅，增長了100%；乙酸含量在整個發酵過程中逐漸增加，而乳酸含量在發酵前12 d逐漸增加，最高達到（4.16±0.62）g/100 g干醅，這與發酵前12 d乳酸菌的大量增殖有密切的關系；發酵12 d之后乳酸含量開始緩慢下降，這可能是因為某些微生物可以將乳酸轉化為其他次級代謝產物所致。

3 結論

四川麩醋發酵過程中醋醅中的水分含量和還原糖含量呈先升后降的趨勢，前者在發酵3 d時含量最高，達到63.90%，后者在發酵9 d時含量最高，達到10.13 g/100 g干醅；pH值逐漸降低，但變化緩慢，且始終維持在4.0～4.4之間；淀粉含量不斷減少，這與微生物對淀粉的不斷降解和生長繁殖代謝對還原糖的利用相關；而總酸含量卻一直處于增長趨勢，揮發酸、不揮發酸變化趨勢與總酸大致相同；氨態酸態氮含量呈逐漸上升的趨勢，且在發酵前期升高得快，后期相對緩慢。在麩醋發酵過程中，醋醅中的有機酸總量逐漸升高，從中共檢測出8種有機酸，分別為草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。發酵過程中有機酸含量差異較大，但均以乙酸與乳酸的含量最高，是發酵過程中的主體有機酸。