酸菜發酵期間細菌群落結構動態變化分析

郝卓莉

（石家莊職業技術學院食品與藥品工程系，河北石家莊 050081）

酸菜是酸漬大白菜的簡稱，是在低鹽浸漬下經過微生物自然發酵而形成的蔬菜發酵制品，是我國特色傳統發酵食品之一[1-2]。由于酸菜的制作環境相對開放或半開放，因而大量不同種類的微生物參與酸菜的發酵[3]，且不同地域環境制作的酸菜中微生物群落結構存在顯著差異。乳桿菌屬（Lactobacillus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、假單胞菌（Pseudomonas）、梭菌屬（Clostridium）和檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）是酸菜發酵的主要微生物菌屬[4]。此外，通過傳統的分離培養發現，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuter）、腸膜明串珠菌屬（Leuconostoc mesenteroides）和米酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）是參與酸菜發酵的主要乳酸菌[5]。

目前，傳統的分離培養技術對酸菜中微生物種類的鑒定非常有限，嚴重低估了微生物豐度和多樣性。此外，鑒于一些微生物具有不可培養的特性，故系統全面地解析酸菜微生物的組成和變化始終是一項重要的挑戰。近年來，16S rRNA高通量測序技術被廣泛應用于傳統釀造食品中復雜微生物群落的研究，高通量測序不僅具有高通量、高覆蓋、高準確率等特點，還可以全面地揭示樣本微生物群落的組成及多樣性等信息[6-7]。馬藝熒[8]研究發現，乳桿菌屬在東北酸菜的細菌菌群中占據主要地位，是東北酸菜中的主要優勢菌群。LIU Z等[9]研究表明，乳桿菌屬和片球菌屬（Pediococcus）是酸菜中的主要微生物菌屬。LIU Z等[10]研究發現，乳桿菌屬、片球菌屬、沙雷氏菌屬（Serratia）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）和魏斯氏菌屬（Weissella）是自制酸菜發酵過程中的主要微生物菌屬。為了解自然發酵酸菜發酵過程中細菌群落的結構組成，本研究按照東北地區傳統方法進行酸菜的腌制，利用16S rRNA高通量測序技術對酸菜發酵細菌群落的動態變化進行全面解析，旨在能夠全面準確地分析酸菜發酵期間的微生物動力學，并為建立酸菜微生物信息數據庫和優化酸菜發酵工藝提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大白菜、食鹽：市售。

E.Z.N.A.? 水樣DNA 提取試劑盒：美國Omega公司；微生物高通量測序建庫試劑盒：北京諾禾致源公司；Phusion HF MM高保真聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）酶：美國BioLabs公司；MinElute? PCR Purification Kit：德國Qiagen公司；Truseq? 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）PCR-Free Sample Preparation Kit：美國Illumina公司；細菌16S rRNA V3-V4區PCR擴增引物（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）：北京諾禾致源公司。

1.2 儀器與設備

Illumina Miseq PE250型測序儀：美國Illumina公司；S1000型PCR儀、CFX96型熒光定量PCR儀、Gel DocTMXR+型凝膠成像系統、低溫冷凍離心機：美國Bio Rad公司；DYY-8C型水平電泳槽：北京六一儀器廠；VORTEX-3型旋渦混勻器：德國IKA公司；BT25S型準微量分析天平：日本SANYO公司；BioPhotometer Plus型核酸蛋白測定儀、5810R型高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；NaneDrop 2000型超微量分光光度計：美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸菜的腌制

根據東北地區傳統方法進行酸菜的腌制[11]，具體方法如下：挑選優質的大白菜，將其在室外晾曬2～3日（曬蔫、殺菌、去除一定的水分）后，摘除黃葉、老幫并清洗干凈，將整顆大白菜縱劈成兩半，浸入沸水煮2 min（使酶失活、改變大白菜中大分子的結構、殺死部分蔬菜細胞、酵母和霉菌），撈出并瀝干水分，冷卻后，整齊擺入5 L的大缸中裝滿壓實，用質量分數為2%的無菌食鹽水填滿密封。用塑料布將發酵罐口扎緊，置于20～25 ℃，相對濕度為40%～65%且避光陰涼的環境進行自然發酵，取發酵1 d、15 d、30 d、45 d、60 d的酸菜水進行微生物的提取，分別命名為SC1、SC15、SC30、SC45和SC60。為保證每次取樣的一致性，在大缸同一部位取3個樣本，置于-20 ℃條件下貯藏備用。

1.3.2 酸菜DNA提取及PCR建庫

利用E.Z.N.A.? 水樣DNA 提取試劑盒提取酸菜液樣本中微生物的基因組DNA。使用引物338F和806R進行PCR擴增，PCR擴增體系（20 μL）：包括模板DNA 10 ng，正向及反向引物各10 pmol，2×Phusion Master Mix 10 μL。擴增程序參考沈毅等[12]的方法，擴增產物使用2%的瓊脂凝膠進行電泳檢測。使用MinElute? PCR Purification Kit對PCR擴增產物進行純化。利用Truseq? DNAPCR-FreeSamplePreparationKit制備測序文庫并添加接頭序列，經NaneDrop2000確定文庫質量，使用Illumina Miseq PE250測序平臺進行高通量測序。

1.3.3 生物信息學分析

采用FLASH軟件[13]對測序的原始數據進行拼接，利用QIIME軟件[14]對低質量的拼接序列進行過濾，使用UCHIME軟件[15]去除嵌合體，從而獲得高質量的Tags序列。根據UCLUST軟件[16]在相似性97%的水平上對序列進行聚類，以所有序列數的0.005%作為閾值過濾操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[17]。利用Silva 132數據庫[18]對OTU進行分類學注釋。使用QIIME軟件[14]對樣本進行多樣性分析。

1.3.4 總酸度的測定

酸菜水中總酸含量采用國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[19]方法測定。

2 結果與分析

2.1 樣本測序數據處理結果

不同發酵時期酸菜樣本的細菌16S rRNA V3-V4區序列的測定結果見表1。

表1 酸菜發酵期間樣本測序數據處理結果統計Table 1 Statistics of sequencing data processing results during sauerkraut fermentation

由表1可知，5個不同發酵時期的酸菜樣本共檢出466 132條原始序列，通過相關軟件過濾后最終得到391 964條有效序列。去除條形碼（barcode）和引物后，5個不同發酵時期的酸菜樣本的平均堿基長度均在450 bp以上，且平均鳥嘌呤（guanine，G）和胞嘧啶（cytosine，C）所占的比率（G+C含量）為54.46%。此外，5個酸菜樣本的Q30值（Q30為質量值＞30的堿基占總堿基數的百分比）均高于90%，說明測序數據可靠且質量較好。

稀疏性曲線是判定樣本的取樣大小是否合理及確定測序深度是否可以覆蓋整個群落。5個不同發酵時期的酸菜樣本的稀疏性曲線的變化見圖1。

圖1 酸菜發酵期間樣本細菌群落的稀疏性曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacterial community of samples during sauerkraut fermentation

由圖1可知，不同顏色的稀疏性曲線代表該發酵時期樣本的稀疏平均值，隨著測序深度的增加，被檢測發現的OTU呈先迅速增加，后趨于平穩的趨勢，說明測序深度足夠的覆蓋整個酸菜發酵的群落。從而進一步說明16S rRNA高通量測序技術有助于全面解析酸菜微生物群落的組成。

2.2 細菌群落的多樣性分析

在97%的相似度閾值下，對391 964條有效序列進行聚類分析，根據QIIME軟件進行OTU劃分，并根據得到OTU進行Alpha多樣性分析，結果見表2。

表2 酸菜發酵期間樣本細菌Alpha多樣性結果統計Table 2 Statistics of Alpha diversity results of bacteria during sauerkraut fermentation

由表2可知，酸菜發酵1 d、15 d、30 d、45 d、60 d樣本中細菌的OTU數量分別為128個、101個、89個、92個和95個。SC1細菌群落的ACE指數、Chao1指數和Shannon指數最大，且Simpson指數最小，表明SC1中細菌菌群的多樣性最高。酸菜的發酵是由多種微生物共同調節，從而促進其發酵的不斷進行。隨著發酵時間的不斷進行，酸菜樣本中細菌群落的ACE指數、Chao1指數和Shannon指數呈先降后緩慢增加的趨勢，而Simpson指數則呈相反的趨勢。這與DU R等[20]的研究結果一致，推測與酸菜發酵液的環境變化有關，一些不耐酸或不耐鹽的微生物在低pH且低鹽環境下生長受到抑制。

進一步對不同發酵時期的酸菜樣本中細菌菌群的構成進行比較分析并繪制韋恩（Venn）圖，結果見圖2。

圖2 不同發酵時期的酸菜發酵樣本中操作分類單元（OTU）的Venn圖Fig.2 Venn diagram of operational taxonomic unit in sauerkraut fermentation samples with different fermentation period

由圖2可知，5個不同發酵時期點的樣本共有的OTU數為65個，而酸菜發酵期間1 d、15 d、30 d、45 d和60 d樣本中細菌的OTU數量分別為41個、5個、4個、7個和7個。結合Alpha多樣性分析結果，多樣性最豐富的發酵SC1樣本中存在41個特有的OTU，凸顯酸菜原料中微生物菌群的復雜性和特殊性。

對上述得到的OTU表進行Beta多樣性分析，利用非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）分析對酸菜樣本中細菌群落的演替進行分析，結果見圖3。

圖3 基于酸菜發酵樣本的細菌群落結構的非度量多維尺度法分析Fig.3 Non-metric multidimensional scaling analysis of fermented sauerkraut samples based on the structure of bacterial community

由圖3可知，NMDS的結果表明酸菜發酵期間細菌群落在NMDS1和NMDS2的分布是不同的，這就意味著在酸菜發酵過程中細菌群落存在差異。SC1樣本與其他樣本之間的距離最遠，說明SC1樣本中細菌群落結構與其他樣本差異最大。而SC45和SC60這兩個樣本之間的距離最近，說明SC45和SC60樣本的酸度變化比較穩定，且細菌群落結構相近似。此外，根據NMDS結果可知，酸菜發酵期間細菌群落的變化呈類似拋物線的趨勢變化，說明某些主要的微生物影響了酸菜發酵過程，可能正是這些微生物推動酸菜的發酵。

2.3 細菌群落的結構分析

在劃分OTU后，挑選不同OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，隨后與微生物參考數據庫進行97%相似性比對分析，從而對酸菜發酵期間得到的每個OTU進行分類學鑒定，在分類學門水平揭示酸菜發酵期間細菌群落的結構差異，結果見圖4。

由圖4可知，酸菜發酵期間的細菌群落分別來自酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和變形菌門（Proteobacteria）。其中擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門占整個測序序列的98%左右。這與LIU Z等[9]的研究結果相一致，說明這些門水平的微生物決定酸菜的發酵性能。此外，在酸菜發酵期間，變形菌門的相對豐度隨著發酵的不斷進行而降低，而厚壁菌門的相對豐度則隨著發酵的不斷進行而增加。SC1樣本中厚壁菌門的相對豐度只有9.64%，然而SC60樣本中厚壁菌門的相對豐度增加至97.97%。說明這些來自厚壁菌門的微生物都具有厭氧和耐酸等生長特性。

圖4 基于門水平酸菜發酵樣本中的細菌群落結構分析Fig.4 Analysis of bacterial community structure in fermented sauerkraut samples based on phylum level

為了進一步準確揭示酸菜發酵期間細菌群落的結構，故從分類學的屬水平探究構成酸菜發酵細菌群落的組成，并揭曉其在發酵過程中的變化規律，結果見圖5。

圖5 基于聚類分析和屬水平酸菜發酵樣本中的細菌群落結構分析Fig.5 Analysis of bacterial community structure in fermented sauerkraut samples based on cluster analysis and genus level

由圖5可知，通過聚類分析發現SC1與其他樣本的距離是最遠的，而SC45和SC60則可以聚在同一個分支。這個結果與圖3的結果是相一致，說明在酸菜發酵過程中微生物的結構發生了顯著變化，從而導致功能也發生了明顯變化，進而促進酸菜的發酵。此外，將相對豐度＞1%的屬定義為優勢細菌屬。SC1樣本中的優勢細菌屬主要隸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）（23.26%）、腸桿菌屬（Enterobacter）（20.60%）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingomonas）（10.21%）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）（6.63%）、乳球菌屬（Lactocccus）（6.62%）、寡養單胞菌屬（Stentrophomonas）（5.21%）、歐文氏菌屬（Ewingella）（2.99%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（2.99%）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）（2.33%）、明串珠菌屬（Leuconostoc）（1.66%）、沙雷氏菌屬（Leuconostoc）（1.66%）、堅固桿菌屬（Pectobacterium）（1.66%）、類香味菌屬（Myroides）（1.33%）和微小桿菌屬（Exiguobacterium）（1.33%）。這與DU R等[20]的研究結果相似，但其在酸菜發酵初期沒有檢測到鞘氨醇桿菌屬和檸檬酸桿菌屬，且假單胞菌屬的相對豐度要遠高于本研究結果，而明串珠菌屬的相對豐度顯著低于本研究結果，說明環境的差異造就酸菜發酵初期微生物群落結構的差異。鞘氨醇桿菌屬和檸檬酸桿菌屬均廣泛存在于我國的傳統發酵食品中，如醋[21]和辣白菜[10]。假單胞菌屬存在于新鮮蔬菜中，生存能力強，適應環境范圍廣[22]。

隨著發酵的不斷進行，具有耐酸且厭氧特性的微生物可在該環境中迅速生長繁殖，并占領足夠多的生態位，而不耐酸的微生物的生長則受到抑制。由圖5可知，SC15樣本中的優勢細菌屬主要隸屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）（45.16%）、乳球菌屬（34.68%）、明串珠菌屬（6.13%）、假單胞菌屬（3.45%）、腸桿菌屬（2.35%）和魏斯氏菌屬（Weissella）（1.25%），相比SC1樣本，乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏菌屬的相對豐度顯著增加，假單胞菌屬和腸桿菌屬則顯著降低，說明乳酸菌是驅動酸菜發酵的主要微生物。其他樣本中的優勢細菌屬主要來自明串珠菌屬、乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬和鹽單胞菌屬（Halomonas）。說明酸菜的發酵會顯著改變微生物的群落結構和組成。此外，本研究發現明串珠菌屬和乳酸乳球菌屬的相對豐度的變化在酸菜發酵期間呈先增后降的趨勢。有趣的是，在SC60樣本中不能檢測出乳酸乳球菌屬，而明串珠菌屬的相對豐度仍還有4.40%。說明明串珠菌屬能耐受更低的pH環境，這與SONG H S等[23]的研究相似，其發現在自然發酵50 d的韓國泡菜中明串珠菌屬的相對豐度為35%。鹽單胞菌屬、魏斯氏菌屬和乳酸桿菌屬的相對豐度則在酸菜發酵過程中持續增加。在酸菜發酵期間，鹽單胞菌屬的相對豐度從0.03%增加至1.84%，而魏斯氏菌屬的相對豐度則從0.01%增加至8.26%。鹽單胞菌屬具有耐鹽的特性，能分解葡萄糖，產生多種風味物質，推測其的存在與生產酸菜“鹽漬”這一步驟有關[24]。魏斯氏菌屬廣泛存在與含鹽的發酵食品中，可參與生成醛、醇和酮等揮發性風味物質，還可使發酵食品的顏色更鮮亮和口感更醇厚[25]。SC1樣本中乳酸桿菌屬的相對豐度極低，僅僅只有0.01%，而僅僅發酵15 d就可達到45.16%，說明乳桿菌屬可以迅速適應酸菜的發酵環境，從而快速生長繁殖。而SC60樣本中的相對豐度可增加至82.32%，相比SC1樣本中乳桿菌屬的相對豐度增加了8 000多倍。乳酸菌是酸菜發酵最為重要的微生物之一，其在發酵期間可產生大量的有機酸（如乳酸、檸檬酸、乙酸等），導致酸菜發酵液的pH降低，進一步抑制其他雜菌的生長繁殖。此外，乳酸菌不僅具有抑制腐敗微生物的生長的能力，還可以延長發酵食品的保質期，提高產品的質量安全[26]。乳酸菌產生的乳酸，是酸菜酸味的主要來源，且在發酵過程中能與醇、醛和酮類物質發生反應，產生大量的揮發性風味物質[27]。

2.5 酸菜發酵過程中酸度的變化及相關性分析

酸度是決定酸菜產品品質的重要因素之一，酸菜發酵過程中總酸含量的變化見圖6。

圖6 酸菜發酵過程總酸含量的變化Fig.6 Changes of total acid contents during sauerkraut fermentation period

由圖6可知，酸菜發酵起始總酸含量為0.02 g/100 mL，隨著發酵進行逐漸上升，于發酵45 d達到穩定，其總酸含量為0.62 g/100 mL，而發酵60 d后達到最高0.65 g/100 mL。說明酸菜發酵45 d就可達到成熟。

進一步對酸菜發酵過程中總酸和主要微生物菌屬的變化進行相關性分析，為了降低錯誤率，只保留相關系數R＞0.6和顯著性（P＜0.05）值結果見圖7。

由圖7可知，總酸與乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和魏斯氏菌屬呈正相關，而與其他發酵過程中的主要微生物菌屬呈負相關，說明乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和魏斯氏菌屬是驅動酸菜成熟的主要微生物菌屬，總酸是影響酸菜發酵過程中細菌菌群結構變化的重要因素之一。乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和魏斯氏菌屬與假單胞菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、歐文氏菌屬、不動桿菌屬、沙雷氏菌屬和水棲菌屬呈負相關，說明與乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和魏斯氏菌屬呈負相關的微生物菌屬大部分都是不耐酸的微生物菌屬，不能在酸菜發酵環境生長繁殖。

圖7 酸菜發酵過程中總酸與屬水平微生物之間的相關性Fig.7 Correlation analysis between total acid and bacterial communities in genes level during sauerkraut fermentation period

3 結論

本研究利用16S rRNA高通量測序技術主要研究了酸菜發酵過程中的細菌群落結構演替規律。從5個不同發酵時期的酸菜樣本中收集的有效序列的平均堿基長度均在450 bp以上，且平均GC含量為54.46%；在97%相似度水平下聚類分析得到各樣本的OTU數分別為128個、101個、89個、92個和95個。不同發酵時期酸菜樣本的微生物群落結構和多樣性均存在一定的差異，其中發酵第1天的酸菜樣本中微生物豐富度和多樣性最高。但隨著發酵的不斷進行，微生物豐度度和多樣性呈先降后緩慢增加的趨勢。結果表明，細菌群落結構與發酵進程顯著相關，因此不同發酵時期優勢菌屬不同。酸菜發酵期間的主要優勢細菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、鹽單胞菌屬（Halomonas）和魏斯氏菌屬（Weissella）等，乳酸菌占據絕對的優勢地位。本研究可為建立酸菜微生物信息數據庫和優化酸菜發酵工藝提供一定的理論基礎。