酶解對(duì)霉菌發(fā)酵乳風(fēng)味的影響

汪亞彬，周 蕾，謝擁葵，汪建明*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.北京市朝陽區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100123；3.新疆天牛乳業(yè)有限公司，新疆伊犁 835704）

牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富，能夠提供維持人體健康需要的膳食營(yíng)養(yǎng)素[1]。對(duì)生牛乳、生羊乳或乳粉進(jìn)行發(fā)酵處理，還可以產(chǎn)生幫助機(jī)體腸胃蠕動(dòng)和胃液分泌的有機(jī)酸[2]，維持機(jī)體健康。

發(fā)酵乳即此類乳制品的統(tǒng)稱，其中包括干酪、酸牛乳、發(fā)酵奶油、開菲爾等繁多種類[3]，張?zhí)m威[4]根據(jù)發(fā)酵乳發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌種不同，將其劃分為了Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。發(fā)酵乳的pH一般較低，酸性條件可以抑制大部分細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，但無法抑制耐酸性微生物（如霉菌、酵母菌等）的污染[5]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和副干酪乳桿菌對(duì)霉菌發(fā)酵乳有明顯的抑菌效果[6]。

隨著我國(guó)居民生活質(zhì)量的提高，越來越多的人開始重視乳制品的攝入，近年來我國(guó)發(fā)酵乳制品的產(chǎn)銷量持續(xù)攀升[7]。發(fā)酵乳制品中的風(fēng)味物質(zhì)一般是由發(fā)酵菌群產(chǎn)生的乳酸和各種揮發(fā)性有機(jī)芳香物質(zhì)組成的，其中包括碳?xì)浠衔铩Ⅴヮ悺⒋碱悺⑷╊惖萚8-9]。根據(jù)周海珍[10]的研究，在霉菌發(fā)酵牛乳制備干酪工藝中宜選用卡地干酪青霉組中的白酪青霉，有助于發(fā)酵乳制品中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生。當(dāng)生牛乳等天然奶產(chǎn)品被酶解后，產(chǎn)品的奶香更為柔和適口，且增加了乳制品的風(fēng)味[11]。在乳品行業(yè)中，應(yīng)用酶解反應(yīng)可有效改善乳制品的品質(zhì)[12]。其中乳脂肪更是與乳制品的感官品質(zhì)關(guān)系密切[13]，在被酶解的過程中可以產(chǎn)生大量風(fēng)味物質(zhì)，不僅使產(chǎn)品更具風(fēng)味，而且可以延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期、增加體系的穩(wěn)定性[14]。發(fā)酵乳酶解后會(huì)產(chǎn)生一些非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，如游離氨基酸（free amino acid，F(xiàn)AA）和游離脂肪酸（free fat acid，F(xiàn)FA）。一般用高效液相色譜法測(cè)定游離氨基酸，用氣相色譜法測(cè)定游離脂肪酸；對(duì)于一些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）進(jìn)行研究[15-16]。

本試驗(yàn)通過采用脂肪酶和蛋白酶對(duì)霉菌發(fā)酵乳進(jìn)行酶解，以酶解液的游離脂肪酸含量、脂解率和游離氨基酸含量為檢測(cè)指標(biāo)，采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化脂肪酶和蛋白酶酶解工藝條件，以獲得風(fēng)味物質(zhì)豐富的發(fā)酵乳產(chǎn)品，為進(jìn)一步增強(qiáng)牛乳風(fēng)味的研究與應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂乳粉：新疆天牛乳業(yè)有限公司；脂肪酶PICCANTASER800（10000U/g）、蛋白酶MAXIPROCPP（15100U/g）：帝斯曼（中國(guó)）有限公司；卡地青霉（Penicilium candidum）：杜邦丹尼斯克公司；所有分離用有機(jī)溶劑（分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LE438系列pH電極，AB204-N型電子分析天平：梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；GZX-9030MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HJ-6A數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器：上海易友儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 霉菌發(fā)酵乳的制備

將全脂乳粉以1∶5（g∶mL）的比例溶解倒入無菌三角瓶中，進(jìn)行105 ℃、15 min滅菌處理，在無菌條件下接種5%活化后的卡地青霉霉菌，于29℃、95r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)4 d[17]。

1.3.2 脂肪酶酶解工藝條件優(yōu)化

以脂肪酶酶解液FFA含量和脂解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察脂肪酶添加量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）及酶解時(shí)間（3 h、4 h、5 h、6 h、7 h）對(duì)脂肪酶酶解的影響。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以脂肪酶添加量（A）、酶解溫度（B）和酶解時(shí)間（C）為3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以酶解后發(fā)酵乳的FFA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件，脂肪酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 脂肪酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis conditions optimization by lipase

1.3.3 蛋白酶酶解工藝條件優(yōu)化

以蛋白酶酶解液FAA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察蛋白酶添加量（0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）、酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）及酶解時(shí)間（3 h、4 h、5 h、6 h、7 h）對(duì)蛋白酶酶解的影響。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蛋白酶添加量（D）、酶解溫度（E）和酶解時(shí)間（F）為3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以酶解后發(fā)酵乳的FAA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件，蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis conditions optimization by protease

1.3.4 測(cè)定方法

游離脂肪酸含量（FFA）：采用滴定法進(jìn)行測(cè)定[18]；游離氨基酸（FAA）含量：采用甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定[19-20]。

酸值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)LS/T 6107—2012《動(dòng)植物油脂酸值和酸度測(cè)定自動(dòng)滴定分析儀法》進(jìn)行測(cè)定；皂化值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5534—2008《動(dòng)植物油脂皂化值的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定，并做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

脂解率計(jì)算公式如下：

式中：AV為酸值，mg/g；SV為皂化值，mg/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶酶解工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶添加量對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)中FFA含量和脂解率的影響

圖1 不同脂肪酶添加量對(duì)脂肪酶酶解發(fā)酵液游離脂肪酸和脂解率的影響Fig.1 Effects of different lipase additions on free fatty acid and lipid hydrolysis rate of fermentation liquid by lipase

由圖1可知，在脂肪酶添加量為1.5%時(shí)，F(xiàn)FA含量和脂解率最大，分別為7.19%和67.54%。當(dāng)酶底物的添加量和底物達(dá)到合適的配比時(shí)，酶的反應(yīng)效果會(huì)更好，酶活力也相對(duì)較強(qiáng)，添加量過多或過少會(huì)使酶和底物的接觸過大或不足，反應(yīng)效果會(huì)受影響，導(dǎo)致酶解過度或不足，產(chǎn)生的FFA含量少。因此選擇脂肪酶的最佳添加量為1.5%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 酶解溫度對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)中FFA含量和脂解率的影響

圖2 不同酶解溫度對(duì)脂肪酶酶解發(fā)酵液游離脂肪酸和脂解率的影響Fig.2 Effects of different enzymatic hydrolysis temperature on free fatty acid and lipid hydrolysis rate in fermentation liquid by lipase

由圖2可知，酶解溫度在45 ℃時(shí)發(fā)酵液的FFA含量和脂解率最高，分別為7.33%和66.39%。當(dāng)酶解溫度低于45 ℃之前酶活力不高，酶解反應(yīng)不徹底，酶解效果不佳；當(dāng)酶解溫度高于45 ℃之后，會(huì)使酶活力下降，使得酶解反應(yīng)進(jìn)行緩慢，F(xiàn)FA含量和脂解率較低。因此選擇脂肪酶的最佳酶解溫度為45 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)中FFA含量和脂解率的影響

圖3 不同酶解時(shí)間對(duì)脂肪酶酶解發(fā)酵液游離脂肪酸和脂解率的影響Fig.3 Effects of different enzymatic hydrolysis times on free fatty acid and lipid hydrolysis rate in fermentation liquid by lipase

由圖3可知，酶解5 h后得到的發(fā)酵液FFA含量和脂解率最高，分別為7.76%和66.73%。在3～5 h時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)FA含量和脂解率逐漸升高，說明酶活力大，反應(yīng)較快，脂肪酶發(fā)揮作用主要是在作用位點(diǎn)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶的作用點(diǎn)變少，使酶解反應(yīng)變慢，脂解率降低。因此選擇脂肪酶的最佳酶解時(shí)間為5 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 脂肪酶酶解工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素，以FFA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定脂肪酶最佳酶解條件。L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表3。

表3 脂肪酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis process optimization by lipase

由表3可知，各因素對(duì)游離脂肪酸的影響大小次序?yàn)锽＞A＞C，即酶解溫度＞酶添加量＞酶解時(shí)間。綜合考慮各因素k值和R值，確定脂肪酶酶解最佳條件為A2B2C2，即脂肪酶添加量為1.5%，酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為5 h。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，游離脂肪酸含量為8.17%。

2.3 蛋白酶酶解工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 酶添加量對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)中FAA含量的影響

圖4 不同蛋白酶添加量對(duì)蛋白酶酶解發(fā)酵液游離脂肪酸的影響Fig.4 Effects of different protease additions on free fatty acid in fermentation liquid by protease

由圖4可知，在蛋白酶添加量為0.15%時(shí)，F(xiàn)AA含量最大為0.392%。當(dāng)添加量＜0.15%之前，蛋白酶與底物接觸面大，隨著含量增加，酶活力增加，F(xiàn)AA含量逐漸增加；當(dāng)添加量＞0.15%之后，加酶量過多蛋白酶與底物接觸不完全，使發(fā)酵受抑制，F(xiàn)AA含量逐漸降低。因此選擇蛋白酶的最佳添加量為0.15%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.2 酶解溫度對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)中FAA含量的影響

由圖5可知，酶解溫度在55 ℃時(shí)，F(xiàn)AA含量最大為0.406%。當(dāng)酶解溫度低于55 ℃時(shí)，蛋白酶活力較弱；當(dāng)酶解溫度高于55 ℃之后，過高的溫度會(huì)使蛋白結(jié)構(gòu)損壞，發(fā)生變形甚至失活，酶解溫度過低或過高都不能很好得使蛋白酶發(fā)揮作用。因此選擇蛋白酶的最佳酶解溫度為55 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 不同酶解溫度對(duì)蛋白酶酶解發(fā)酵液游離脂肪酸的影響Fig.5 Effects of different enzymatic hydrolysis temperature on free fatty acid in fermentation liquid by protease

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)中FAA含量的影響

圖6 不同酶解時(shí)間對(duì)蛋白酶酶解發(fā)酵液游離脂肪酸的影響Fig.6 Effects of different enzymatic hydrolysis time on free fatty acid in fermentation liquid by protease

由圖6可知，酶解時(shí)間為5 h時(shí)測(cè)得的FAA含量最高為0.371%，當(dāng)酶解時(shí)間＜5 h時(shí)，可能是酶解時(shí)間太短使得酶解不徹底，F(xiàn)AA含量降低；而酶解時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致酶解產(chǎn)生的多肽物質(zhì)對(duì)酶解反應(yīng)的進(jìn)行產(chǎn)生一定的抑制作用，使酶解反應(yīng)變慢，從而FAA含量降低。因此選擇蛋白酶的最佳酶解時(shí)間為5 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 蛋白酶酶解工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for enzymatic hydrolysis process optimization by protease

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素，以FAA含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定蛋白酶最佳酶解條件。L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表4。

由表4可知，各因素對(duì)游離氨基酸影響的大小次序?yàn)镈＞F＞E，即酶添加量＞酶解時(shí)間＞酶解溫度。綜合考慮各因素k值和R值，確定蛋白酶酶解最佳條件為D2E2F3，即蛋白酶添加量為0.15%，酶解溫度為55 ℃，酶解時(shí)間為5.5 h。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，游離氨基酸含量為0.413%。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定脂肪酶和蛋白酶對(duì)霉菌發(fā)酵乳進(jìn)行酶解的最佳工藝條件為：脂肪酶添加量為1.5%，酶解溫度為45 ℃，酶解時(shí)間為5 h；蛋白酶添加量為0.15%，酶解溫度為55 ℃，酶解時(shí)間為5.5 h。在此工藝條件下，發(fā)酵乳中非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量最為豐富，為進(jìn)一步增強(qiáng)牛乳風(fēng)味的研究與應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。