混菌制曲和醬渣添加對黃豆醬理化指標動態變化的影響

劉 丹，葛予寧，徐 晗，石 磊，李貞景，，陳 明，周慶禮，，王昌祿，張志軍

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津市利民調料有限公司，天津 300308；3.天津市營養代謝食品工程技術中心，天津 300457；4.國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津）農業農村部農產品貯藏保鮮重點實驗室天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384）

黃豆醬又稱豆醬、黃醬、大醬等，是以黃豆、面粉為主要原料，食鹽、水為輔料，利用米曲霉（Aspergillus oryzae）為主要微生物，經發酵而成的半流動狀態的食品，是我國北方傳統的豆制發酵食品，因其獨特的風味特征而廣受消費者的喜愛[1]。黃豆醬發酵最初接種單菌種進行制曲，但單菌種所形成的酶系比較單一，使得蛋白質和糖分分解不徹底，發酵基質利用率低。近年來，研究者致力于通過豐富曲中的微生物或其酶系來提高發酵食品的品質。李志江等[2]利用米曲霉和黑曲霉共培養制作黃豆醬醬曲，有效提高了曲中各酶系的活性；古小露[3]接種復合菌進行制曲和發酵，有效提高了豆醬的氨基酸態氮和總酯的含量。

紅曲霉（Monascus）是自然界中廣泛存在的一類絲狀腐生真菌，作為我國傳統食品的發酵用菌，紅曲霉在中國的應用已有上千年的歷史，是我國重要的微生物資源。紅曲霉不僅能產生紅曲色素、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和Monacolin K等多種功能物質，且可產生淀粉酶、糖化酶、酯化酶等多種酶，在釀酒等發酵行業有著廣泛的應用[4]。楊愛華等[5]在郫縣豆瓣曲中添加紅曲霉和米曲霉，不僅改善了郫縣豆瓣的色價和感官品質，還提高了郫縣豆瓣的營養價值。醬渣也稱醬油渣或醬油糟，是醬油生產中原料發酵后產生的固體殘渣。其中含有豐富的糖、粗蛋白、纖維和油脂等營養物質，還含有豐富的多肽、異黃酮和蛋白黑素等生理活性物質，具有較大的再利用價值[6]。我國醬油年產量巨大，由此產生的副產物醬渣的量也非常可觀，醬渣水分含量大，運輸困難，又極易腐敗變質，如果不能有效處理就會給環境造成負擔。徐晗等[7]研究了醬渣添加對黃豆醬品質的影響，結果表明，添加適量醬渣可在一定程度上提高黃豆醬的風味。

本研究采用米曲霉與紅曲霉混合培養制備黃豆醬大曲，并在發酵基質中添加適量醬渣，改良黃豆醬的發酵體系，對黃豆醬發酵過程中各理化指標的動態變化進行監測，并分析了純黃豆醬與改良后的黃豆醬在感官指標上的差異，旨在闡明混合制曲和醬渣添加對黃豆醬理化指標及感官品質的影響，為豐富黃豆醬發酵微生物資源和醬渣的高值化利用提供參考，在微生物混合制曲縮短豆醬發酵周期、提高醬渣利用率、進一步豐富豆醬市場的產品種類和結構等方面具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬渣（含水量69%，含鹽量14%）、米曲霉（Aspergillus oryzae）滬釀3.042：天津市利民調料有限公司；面粉、黃豆、食鹽：市售；紫色紅曲霉（Monascus purpureus）：天津科技大學發酵食品與益生菌開發實驗室；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：上?？曝S化學試劑有限公司；硝酸銀（分析純）：西格瑪奧德里奇貿易有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市化學試劑供銷公司。

1.2 儀器與設備

T1000 分析天平：日本SHIMADZU公司；SevenEasy pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；CL-32L 高壓滅菌鍋：日本ALP公司；QP2010 Ultra 氣質聯用儀：日本島津公司；TE32 TA.XT.Plus 質構儀：英國Stable Micro System公司；CM-5 色差儀：柯尼卡美能達投資有限公司；M200 PRO酶標儀：帝肯（上海）貿易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵種曲的制備

米曲：單獨接種米曲霉，接種量為0.04%，30 ℃培養48 h。

混合曲：紅曲霉與米曲霉混合接種，其中米曲霉接種量為0.04%，紅曲霉接種量為1.5%，將混合物料裝盤置于恒溫培養箱，30 ℃堆積培養至16 h翻曲一次，繼續堆積培養8 h后進行第二次翻曲，平鋪培養48 h。

1.3.2 黃豆醬制作工藝流程

操作要點：

將面粉與種曲混合均勻，與冷卻至40 ℃左右的黃豆進行拌合，黃豆與面粉干質量比為4∶1。

純黃豆醬發酵所用種曲為米曲，其接種量為原料干質量的0.04%，60 g成曲與鹽水（含鹽量90%）以1.0∶0.9的比例混合于240 mL玻璃瓶中制成發酵醅，40 ℃恒溫發酵30 d；接種紅曲醬渣醬發酵所用種曲為混合曲，其接種量為原料干質量的0.04%，以10%醬渣代替成曲，與鹽水（含鹽量90%）以1.0∶0.9的比例混合制成發酵醅，40 ℃恒溫發酵30 d，每個條件下均設置3個平行發酵樣品。制醬操作要點具體參照文獻[7]。

1.3.3 測定方法

氨基酸態氮和總酸含量的測定：采用酸度計法測定總酸和氨基酸態氮，具體參照GB 5009.235—2016 食品中氨基酸態氮的測定[8]。

還原糖的測定：采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定黃豆醬還原糖，具體參照文獻[9]。

鹽分測定：采用銀量法測定黃豆醬鹽分，具體參照GB 5009.44—2016 食品中氯化物的測定[10]。

黃豆醬色差測定：采用CM-5型色差儀測定成品醬亮度、紅色指數及黃色指數，讀數以CIE1976色度空間值L*（暗→亮：0→100）、a*（綠→紅+）、b*（藍→黃+）表示，具體操作參照文獻[7]。

黃豆醬質構測定：利用TA.XT.Plus型質構儀對成品醬硬度、稠度、內聚性和粘性指數進行測定，具體操作參照文獻[7]。

黃豆醬風味物質測定：采用固相微萃取-氣質聯用對黃豆醬中的風味物質進行測定。具體方法設置參照文獻[7]。風味物質的定性分析：將質譜儀記錄的質譜圖和計算機檢索譜庫的標準質譜圖進行對照，鑒定、分析化合物，確定豆醬的風味物質。

黃豆醬的感官評定：黃豆醬的感官評定采用評分法。根據國標GB/T24399—2009《黃豆醬》[11]感官要求制定感官評定表1。由12名食品專業的研究生根據表中的4個感官指標進行品評和打分，統計各指標的評定結果，比較兩種黃豆醬的感官差異。

表1 黃豆醬感官評定標準Table 1 Standards of sensory evaluation of soybean paste

2 結果與分析

2.1 發酵過程中黃豆醬理化指標的動態變化

2.1.1 氨基酸態氮含量的動態變化

圖1 兩種黃豆醬發酵過程中氨基酸態氮含量的變化Fig.1 Change of amino acid nitrogen contents in two kinds of soybean paste during the fermentation

由圖1可知，發酵前7 d，兩種黃豆醬的氨基酸態氮含量均隨發酵時間的延長而急劇上升，豆醬中微生物代謝產生的大量蛋白酶將蛋白質降解為游離氨基酸和小分子多肽，使得氨基酸態氮含量迅速增加；發酵8～21 d，兩種黃豆醬的氨基酸態氮含量增速變緩，此時微生物生長處于動態平穩期，蛋白質水解作用增速減緩，但接種紅曲醬渣醬的氨基酸態氮含量始終高于純黃豆醬，這可能是由于紅曲霉與米曲霉生長的協同作用使得蛋白酶含量有所提高；發酵30 d時，兩種黃豆醬的氨基酸態氮含量無顯著差異（P＞0.05），這表明紅曲霉的加入只能加速氨基酸態氮的產生，而對其最終產量影響不大。

2.1.2 總酸含量的動態變化

發酵過程中總酸含量的變化對豆醬的色澤、風味、穩定性及內源酶的活性都有重要影響。由于酸類是發生酯化反應的物質基礎，一定含量的有機酸還可以提升黃豆醬的風味[14]。

圖2 兩種黃豆醬發酵過程中總酸含量的變化Fig.2 Change of total acid contents in two kinds of soybean paste during the fermentation

由圖2可知，發酵前14 d，隨著發酵時間的延長，兩種黃豆醬的總酸含量均呈逐漸上升趨勢，此階段總酸含量迅速積累，醬醪的pH也隨之迅速降低，此后接種紅曲醬渣醬的總酸含量出現短暫的下降，可能是由于總酸的生成量與參與酯化等反應的消耗量未達到平衡造成的；整個發酵過程中接種紅曲醬渣醬的總酸含量均高于對照組，可能的原因是紅曲霉產生的糖化酶促進了還原糖含量的提高，而其中一部分還原糖轉化成了有機酸，這也表明紅曲霉的添加可以加速豆醬有機酸的積累；發酵終止時，兩種黃豆醬的有機酸含量基本相同，這說明發酵周期為30 d時，紅曲霉和醬渣的添加對黃豆醬的有機酸含量沒有明顯的影響。

2.1.3 還原糖含量的動態變化

發酵過程中，淀粉在糖化酶作用下水解產生還原糖，還原糖與氨基酸發生美拉德反應，其反應產物不僅有較強的抗氧化性，還具有抗過敏、降血壓及調節腸道功能的作用[15-16]。醬渣中粗脂肪含量較高，容易發生脂質過氧化反應，所以還原糖不僅能豐富黃豆醬的滋味，還能保持醬渣黃豆醬的品質。

圖3 兩種黃豆醬發酵過程中還原糖含量的變化Fig.3 Change of reducing sugar contents in two kinds of soybean paste during the fermentation

由圖3可知，發酵過程中兩種黃豆醬的還原糖含量均呈先上升后下降的趨勢。發酵前14 d，發酵過程中產生的還原糖大量溶出，還原糖含量持續升高；此后，微生物開始消耗還原糖促進自身生長，鹽濃度的升高在一定程度抑制了淀粉酶酶活，使得還原糖生成量下降，而部分還原糖還會與氨基酸結合形成色素[17]，加速還原糖的消耗，因此在發酵14～21 d這一階段，還原糖含量呈下降趨勢；整個發酵過程中，接種紅曲醬渣醬的還原糖含量明顯高于純黃豆醬，且在第7天和第14天時，兩種豆醬還原糖含量有顯著差異（P＜0.05），這可能與紅曲霉參與制曲有關，紅曲霉在制曲過程中產生的糖化酶、纖維素酶等其他淀粉酶系有利于進一步分解醬渣中的淀粉和纖維素，從而產生更多的還原糖，這一點為黃豆醬的色澤和風味的改善做出非常大的貢獻，且可在一定程度上縮短黃豆醬的發酵周期。

2.1.4 鹽分及水分含量的動態變化

黃豆醬中的食鹽可作為其保鮮劑和增鮮劑，抑制醬中雜菌生長，防止豆醬腐敗變質；但鹽度過高也會抑制不耐鹽優勢菌的生長，影響豆醬的口感和食用者的健康，而鹽度過低又會導致黃豆醬鮮味不足[18]。

由圖4、圖5可知，隨著發酵時間的延長，兩種黃豆醬的鹽分呈比較平穩的增長趨勢，這可能與黃豆醬中水分含量逐漸降低有關；在整個發酵過程中，純黃豆醬的鹽分含量均高于接種紅曲醬渣醬，但發酵結束時，兩種黃豆醬的鹽分含量趨于一致，這說明紅曲霉和醬渣的添加對黃豆醬的鹽分含量幾乎沒有影響。

圖4 兩種黃豆醬發酵過程中鹽分含量的變化Fig.4 Change of salt contents in two kinds of soybean paste during the fermentation

圖5 兩種黃豆醬發酵過程中水分含量的變化Fig.5 Change of water contents in two kinds of soybean paste during the fermentation

2.2 成品醬指標對比分析

2.2.1 色差

食品的色澤對其感官品質有著極為重要的影響，對黃豆醬而言，一定的光澤和鮮艷的紅色能夠很好的促進消費者的食欲。由表2可知，與純黃豆醬相比，接種紅曲醬渣醬的紅色指數明顯高于純黃豆醬，且差異顯著（P＜0.05），這說明適當接種紅曲霉進行混合菌種制曲可以有效改善黃豆醬的色澤。

表2 兩種黃豆醬色差的對比Table 2 Comparison of color difference of soybean sauce

2.2.2 質構

食品的質地是影響消費者對產品質量感覺的重要因素。它對食物的體態、口感及質量穩定性都有較大影響，兩組黃豆醬的質構指標見表3。

由表3可知，接種紅曲醬渣醬比純黃豆醬顯示出更高的硬度、稠度、內聚性和粘性，且差異顯著（P＜0.05）。與純黃豆醬相比，接種紅曲醬渣醬添加了10%的醬渣，這對黃豆醬的固形物含量有較大影響，此外，紅曲霉的加入提高了大曲酶活，使得基質中蛋白質和脂肪進一步分解成游離氨基酸，小分子肽和游離脂肪酸，分子體積的變小和濃度的增加使得分子之間、分子與溶劑之間作用加強，醬缸中液體成分逐漸變稠，硬度增加[19]。綜上，采用添加紅曲霉混合制曲及在發酵基質中添加醬渣的方式可有效增強豆醬稠度、內聚性及粘性指數，有利于形成豆醬特有的流變學特性，提升消費者的喜好感，保持豆醬質量穩定，延長豆醬儲藏期。

表3 黃豆醬質構的對比Table 3 Comparison of texture difference of soybean sauce

2.2.3 風味物質

兩組黃豆醬風味物質的比較見表4及表5。

表4 黃豆醬風味物質的對比Table 4 Comparison of flavor substances of soybean sauce

續表

表5 兩種黃豆醬風味物質比較Table 5 Comparison of flavor substances of two kinds of soybean sauce

由表4及表5可知，純黃豆醬中有34種風味物質，接種紅曲醬渣醬中有57種風味物質；兩種黃豆醬在醛類物質的種類上沒有明顯差異，可能的原因是醬渣干燥儲存過程中油脂氧化分解，有機酸和小分子物質進一步反應導致醛類物質含量下降。

接種紅曲醬渣醬的酯類物質種類明顯比純黃豆醬豐富很多，可能是紅曲的酯化力促進了發酵過程中酯類化合物的積累，另外醬渣豐富的油脂在脂肪酶系的作用下，水解成甘油和脂肪酸，脂肪酸被降解或氧化生成各種單不飽和脂肪酸、多不飽和酸、短鏈脂肪酸、烷烴以及烯烴，此類化合物被進一步氧化和環化也可生成各種醛、酮、內酯、雜環化合物和烷基呋喃等香氣物質[20]。豆醬中的酯類化合物具有高揮發性，極易被人的嗅覺所感知，其不僅是豆醬香氣的重要組成成分，而且對一些具有刺激性的風味有抑制作用，添加紅曲混合制曲和在發酵基質中添加醬渣均對豆醬的風味有良好的改善作用。

2.2.4 感官對比

根據表1 中的感官評定標準評價兩種黃豆醬樣品的品質，結果見表6。

表6 兩種黃豆醬感官評分比較Table 6 Comparison of sensory evaluation of two kinds of soybean paste

由表6可知，接種紅曲醬渣醬比純黃豆醬有更好的感官品質，這表明在接種紅曲霉進行混合制曲的條件下將醬渣應用于黃豆醬中，不僅不會降低其品質還能使其感官品質有所改善。

3 結論

采用米曲霉與紅曲霉混合接種制曲，并在發酵基質中添加適量醬渣，研究純黃豆醬與接種紅曲醬渣醬在理化指標和感官品質方面的差異。結果表明，接種紅曲醬渣醬的氨基酸態氮含量較純黃豆醬無顯著性差異（P＞0.05），但紅曲霉的添加可明顯加速豆醬還原糖的產生，具有縮短豆醬發酵周期的潛力；醬渣的添加顯著提高了黃豆醬的硬度和稠度（P＜0.05），增強了黃豆醬的內聚性和粘性（P＜0.05）；接種紅曲醬渣醬在風味物質種類和感官評分上均優于純黃豆醬。綜上所述，紅曲霉和醬渣的添加可在一定程度上改進黃豆醬的品質，本研究對混合接種制作醬曲及醬渣的高值化利用具有一定的參考價值。