響應面法優化頂頭孢霉發酵稻草秸稈產頭孢菌素C的培養基

陳家麗，姚日生，余婉蓉，詹進鎖，朱慧霞，王 淮

（合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230601）

廉價易得的培養基原料是生物發酵行業一直以來孜孜以求的目標。作為全球最大的谷物生產國，中國2014年的農作物秸稈產量為7億t[1]，如何有效利用這些巨量的秸稈已成為緊迫的環境、資源和社會問題[2]。秸稈類生物質資源在轉化利用過程中，破除抗降解屏障以及纖維素等組分的增值化開發一直是亟待攻克的瓶頸[3-4]。研究表明，經SO3微熱爆聯合稀堿溶液預處理的稻草秸稈[5-6]，在經纖維素酶的水解糖化后所得的糖化液，不僅葡萄糖含量高而且糠醛、乙酸等發酵抑制物含量低，完全可以應用于頭孢菌素C（cephalosporin C，CPC）的發酵，作為原料豐富且廉價的碳源替代物[7]。

作為當前最為重要的β-內酰胺類抗生素，現在全世界每年生產約2 500 t頭孢菌素衍生物，在過去的幾十年中，通過培養基與發酵工藝的優化，CPC的發酵效價得以大幅改善，產量更是增加了一倍以上[8-9]。SHIN H Y等[10]研究發現，在黃曲霉M35產生CPC的過程中，粗甘油可以代替蛋氨酸和植物油，成為半胱氨酸和碳源。CUADRA T等[11]以甘蔗渣為載體研究pH調節和養分濃度對固態發酵產CPC的影響，結果發現CPC產量從468 μg/g升至3 200 μg/g。LOTFYW A等[12-13]利用甜菜糖蜜作為產黃頂孢菌生產CPC的新型碳源，并采用響應面法研究了發酵培養基組成、接種濃度、初始pH和通氣率對CPC產量的影響。

在本課題組前期的研究基礎之上，本研究旨在采用更為廉價易得的培養基，通過響應面法進一步揭示碳源替代后CPC發酵效價改變的原因所在，以尋求培養基組分含量與效價之間的關系，確立最優的培養基組成[14]。為真正實現工業發酵中利用秸稈棕纖維素替換淀粉作為碳源提供依據，對促進我國秸稈增值化利用具有現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

稻草秸稈：中國江蘇省連云港市；頂頭孢霉（Cephalosporium acremonium）CPCC400039：中國藥學微生物菌種保藏管理中心；頭孢菌素C標準品（純度≥99.0%）：上海榕柏生物技術有限公司；D,L-甲硫氨酸、纖維素酶（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；玉米漿、淀粉、葡萄糖（均為生物試劑）、硫酸銨（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；豆油：市售。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

液體種子培養基：葡萄糖5 g/L，蔗糖35 g/L，玉米漿31 g/L，豆油5 g/L，D,L-蛋氨酸0.5 g/L，（NH4）2SO48 g/L，CaCO35 g/L。

標準發酵培養基：葡萄糖40 g/L，糊精20g/L，淀粉30 g/L，玉米漿50 g/L，α-淀粉酶0.2%，豆油50 g/L，（NH4）2SO430 g/L，D,L-蛋氨酸6 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，ZnSO4·7H2O 0.01 g/L，CuSO4·7H2O 0.02 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，KH2PO45 g/L，CaCO35 g/L，FeSO4·7H2O 0.2 g/L。

碳源替代發酵培養基：水解葡萄糖40 g/L，糊精20 g/L，棕纖維素30 g/L，玉米漿50 g/L，纖維素酶0.2%，豆油50 g/L，（NH4）2SO430 g/L，D,L-蛋氨酸6 g/L，MgSO4·7H2O 3 g/L，KH2PO45 g/L，ZnSO4·7H2O 0.01 g/L，CuSO4·7H2O 0.02 g/L，CaCO35 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.2 g/L。

1.2 儀器與設備

LC-16高效液相色譜（highperformanceliquid chromatography，HPLC）儀：島津儀器（蘇州）有限公司；ZHJH-C115C超凈工作臺、ZWY-2102恒溫培養振蕩器：上海智成分析儀器制造有限公司；YXQ-LS立式蒸汽滅菌器：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；AUY120分析天平：日本shimadzu公司；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學院研究所；AMR-100全自動酶標分析儀：杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 秸稈預處理

SO3微熱爆：在帶有毛玻璃塞的250 mL三口燒瓶中，P2O5（22.5 g）和H2SO4（50.0 g）反應，產生約40.82 g三氧化硫氣體，并通入裝有1.0 kg稻草秸稈（切成2～3 cm）的反應罐中，秸稈與氣體在60 ℃反應1 h。

稀堿法：稻草秸稈在SO3微熱爆預處理后，在60 ℃條件下用2%NaOH堿洗220 min，反應罐轉速為150 r/min。反應結束后，將稻草用自來水洗滌至中性，并在60 ℃烘干至質量恒定，然后使用試驗室粉碎機將樣品粗粉碎至約1 mm粒度，于干燥處保存備用。參見文獻[15-16]測定水分、灰分、纖維素、半纖維素、木質素含量。

1.3.2 秸稈酶解糖化

在250 mL錐形瓶中加入10 g秸稈棕纖維素粉末，纖維素酶用量20 FPU/g底物，并用檸檬酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH4.8）調節水解體積為100 mL，置于45 ℃，180 r/min的恒溫振蕩器中酶解72 h。沸水浴10 min結束酶促反應，樣品以8 000 r/min離心10 min，收集上清液即為棕纖維素酶解糖化液，4 ℃保藏備用。以稀堿法預處理作為對照組。通過蒸餾水稀釋或80 ℃濃縮的方式控制糖化液中的葡萄糖濃度。纖維素糖化率的計算公式如下：

1.3.3 菌株培養條件

頂頭孢霉經馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養后，轉接液體培養基，在28 ℃、220 r/min的搖床中培養48 h，再接種到發酵培養基，接種量4.0 mL，置于28 ℃，轉速220 r/min的搖床振蕩培養48 h后，降溫至25 ℃，繼續培養144 h。

1.3.4 發酵生長曲線及水解液木糖的影響

為了解CPC效價與菌體生長的相關性，替代培養基在發酵過程中每隔12 h取樣，檢測發酵液中CPC效價及菌體的生物量，其中生物量的測定采用核酸法[17]。以標準發酵培養基為對照組，繪制發酵生長曲線以及效價曲線。

為測定酶解糖化后木糖對替代效果的影響，分別配制木糖培養基、混合糖培養基（葡萄糖、木糖），以標準培養基（葡萄糖）作為對照，接種發酵結束后，測定CPC效價。

1.3.5 頭孢菌素C效價測定

頭孢菌素C效價的測定采用高效液相色譜法，色譜柱：YWG C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，10 μm）；色譜條件：流動相：85%（V/V）0.2%KH2PO4緩沖液和15%（V/V）甲醇，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，流速：1 mL/min，紫外檢測波長：254 nm，柱溫：室溫，進樣量：20 μL。以頭孢菌素C鈉鹽為標準，外標法計算頭孢菌素C效價，單位U/mL。

1.3.6 Plackett-Burman（PB）試驗設計

本試驗選取6種培養基組分為評價因素，CPC效價（Y）為響應值，進行PB試驗，優化發酵培養基配方，PB試驗設計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

1.3.7 最低添加量試驗

為降低培養基成本，根據PB試驗結果，選取不顯著因素，以合理的步長進行試驗，得出不顯著因素的最低添加量。

1.3.8 最陡爬坡試驗

根據PB試驗結果，選取顯著因素，對其試驗結果進行分析并設計，選擇合適的步長，通過梯度設計確定試驗中心點。

1.3.9 Box-Behnken（BB）中心組合設計

在最陡爬坡試驗結果的基礎上，進行BB設計并確定重要因素的最佳值，用軟件進行二次響應面回歸分析，自變量因素和水平見表2。

表2 Box-Behnken設計試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

2 結果與分析

2.1 秸桿預處理及酶解糖化

由于秸稈類生物質的致密結構，導致其纖維組分始終難以被高效轉化與水解利用。本課題組基于SO3微熱爆技術建立了一種新的秸稈類生物質預處理新方法，對秸稈預處理前后組分含量進行測定，不同方法對結果的影響見表3。

表3 生物質的組分分析Table 3 Compositional analysis of biomass

由表3可知，經預處理后，木質素含量相較原秸稈顯著降低至（5.60±0.1）%，去除率達65.91%，而棕纖維素（纖維素與半纖維素）含量基本不變。這表明該預處理在有效破解木質纖維素類生物質抗降解屏障的同時，有效避免了“糖”組分的損失，預處理對秸稈棕纖維素酶解糖化的影響見圖1。

圖1 預處理對酶解糖化的影響Fig.1 Effect of pretreatment on enzymatic hydrolysis and saccharification

由圖1可知，隨著時間的延長，經過SO3微熱爆＋稀堿預處理的秸稈棕纖維素糖化率為95.13%，稀堿法預處理糖化率為88.45%。這表明，SO3微熱爆預處理對稻草細胞壁最外層木質素的去除，增加了纖維素酶的可及性，提升了酶解效率，是一種十分有效的促進秸稈生物轉化利用的預處理方法。

2.2 碳源替代對發酵的影響

2.2.1 發酵生長曲線

為探究碳源替代對于頂頭孢霉生長代謝的影響，分別測定了菌體在標準發酵培養基和碳源替代培養基中CPC效價及生物量隨時間的變化曲線，結果見圖2。

圖2 頂頭孢霉發酵生長曲線及頭孢菌素C效價曲線Fig.2 Fermentation growth curve of Cephalosporium acremonium and titer curve of cephalosporin C

由圖2可知，碳源的替換對于該微生物的生長代謝有一定影響。碳源替換后，菌體的生物量和CPC的效價均低于標準發酵培養基中的相應值。可能在于半纖維素酶解后所得的木糖對于發酵的抑制，也可能是由于碳源替換后，培養基組成之間存在相互影響，未達到最佳狀態。

2.2.2 水解液木糖的影響

為揭示在本研究中木糖的存在對于CPC的發酵是否存在抑制作用，考察木糖對于發酵過程的影響，結果見圖3。

圖3 木糖對頂頭孢霉發酵產頭孢菌素C的影響Fig.3 Effect of xylose on cephalosporin C production by Cephalosporium acremonium fermentation

由圖3可知，菌株利用單一的木糖作為碳源時，由于頂頭孢霉對于戊糖的利用能力不足，CPC效價明顯下降。但在相同的碳源濃度下，添加少量的木糖對發酵的抑制作用并不明顯，反而在同等葡萄糖濃度下，木糖的添加使發酵效價有所提升。這表明，糖化液中少量木糖含量的存在，對于本研究中CPC的發酵并無抑制作用。在碳源替換后導致發酵效價降低的可能原因就在于培養基組成之間存在相互影響，未達到最佳狀態。基于此，特采用響應面法進行了培養基組成優化研究。

2.3 Plackett-Burman試驗設計結果與分析

按照Plackett-Burman 試驗設計進行試驗，結果見表4。根據試驗結果進行方差分析，結果見表5。

表4 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

表5 Plackett-Burman試驗設計方差分析Table 5 Analysis of Plackett-Burman experiments design

由表5可知，PB試驗的回歸模型P值為0.000 5＜0.05，表明該回歸模型是顯著的。模型的決定系數R2=0.978 6，說明該模型可解釋97.86%的數據，也說明該回歸模型的擬合度很好。

其中，A、B、C的P值均＜0.01，則說明這三種組分對發酵的影響是極顯著的。究其原因在于水解葡萄糖替代葡萄糖作為速效碳源，為菌體生長的初期提供有效單糖組分，濃度過低會影響發酵前期菌體的生長，但過高的糖濃度則會抑制產物的生成。棕纖維素作為持續碳源，含量過低，會導致菌體生長期間與后續合成CPC時底物供給不足；過高則會造成溶液中固形物含量過高，溶氧水平大幅度降低，限制了菌體的呼吸作用。玉米漿作為氮源，有豐富的氨基酸、蛋白質和微量元素，前期可以刺激菌體大量生長，但過量會導致溶氧抑制、氨基酸抑制等問題。E、F、G對菌株發酵產CPC的影響不顯著（P＞0.05）。

2.4 非顯著因素的最低添加量

根據表5分析可知，E、F、G為不顯著因素，且E和G呈現負效應，F呈現正效應。依據分析結果，對3種組分分別設計合理的步長，進行最低添加量試驗，發酵后測定CPC效價，結果見表6。

表6 不顯著因素最低添加量試驗結果Table 6 Results of the minimum addition of insignificant factors

由表6可知，隨著纖維素酶的增加，CPC效價呈現先上升后下降的趨勢，當纖維素酶添加量達0.8%時，效價達到最大，為235.71 U/mL。隨著豆油含量的增加，效價逐漸增加至最大值251.09 U/mL后下降。當硫酸銨濃度增加時，效價也呈現先上升后下降的趨勢，并于添加量10 g/L時達到最大效價235.43 U/mL。為節約培養基成本，后續試驗纖維素酶、豆油、硫酸銨的添加量分別為0.8%、25 g/L、10 g/L。

2.5 最陡爬坡試驗

表7 最陡爬坡試驗結果Table 7 Results of the steepest ascent experiments

由于水解葡萄糖、棕纖維素、玉米漿的濃度對發酵產CPC的影響是顯著的，為了進一步優化，對這三種組分進行最陡爬坡試驗以確定BB試驗的設計原點。由表5可知，A和C呈現負效應，即隨著質量濃度的增加，發酵產CPC的效價逐漸下降；而B呈現正效應，隨著含量的增加，CPC效價逐漸增加。根據以上分析，設計最陡爬坡試驗如表7。由表7可知，當水解葡萄糖為35 g/L、棕纖維素為45 g/L、玉米漿為35 g/L時，CPC效價最高，達261.54 U/mL，即選擇第4組試驗的用量作為BB設計的中心原點。

2.6 Box-Behnken設計優化培養基組分

根據PB設計以及最陡爬坡試驗結果，選擇水解葡萄糖、棕纖維素、玉米漿濃度3個因素為自變量，以CPC的效價為響應值，設計了3因素3水平的響應面分析試驗，試驗結果如表8所示，利用軟件對數據進行回歸擬合得到回歸方程：Y=291.21+19.90A+13.00B+36.81C-6.20AB-21.01AC+2.28BC-40.92A2-38.58B2-33.16C2。

表8 Box-Behnken試驗設計與結果Table 8 Design and results of Box-Behnken experiments

對上述二次回歸方程進行方差分析，結果見表9。由表9可知，該二次回歸方程模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.097 9＞0.05），回歸方程的相關系數R2=0.990 0，調整相關系數R2adj=0.977 1，說明該回歸方程擬合度很好，能夠較好的反應CPC效價與各因素之間的線性關系。由試驗值可知，水解葡萄糖（A）、棕纖維素（B）、玉米漿（C）的添加量對CPC效價有極顯著的影響（P＜0.01）。二次項A2、B2、C2（P＜0.000 1）對CPC效價的影響也極顯著（P＜0.01）。根據F值大小各因素對發酵產CPC效價的影響程度為：玉米漿（C）＞水解葡萄糖（A）＞棕纖維素（B）。因素AB的交互作用對CPC效價有極顯著的影響（P＜0.001），而AC和BC之間的交互影響不顯著（P＞0.05）。

表9 Box-Behnken試驗設計結果的方差分析Table 9 Variance analysis of Box-Behnken experiments design results

為直觀的反應出各因素及其交互作用對響應值的影響結果，以CPC效價為指標，利用軟件繪制三維響應面及其等高線圖見圖4。等高線的形狀可以反映出各因素的交互作用對響應值的影響[18-20]。

圖4 各因素交互作用對頭孢菌素C效價影響的響應面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on cephalosporin C titer

由圖4a可知，響應面等高線接近于圓形，說明交互作用不明顯，當水解葡萄糖的量不變時，隨著棕纖維素質量濃度的增加，效價先增加后減小，當棕纖維素的量不變時，效價隨著水解葡萄糖濃度的增加也呈現先增加后減小的趨勢。由圖4b和圖4c可知，水解葡萄糖和玉米漿的交互影響及棕纖維素和玉米漿的交互影響同樣存在相同的變化趨勢。由圖4b分析可知，水解葡萄糖和玉米漿的交互影響顯著，這和方差分析結果保持一致。

2.7 驗證試驗

通過軟件分析可得頂頭孢霉出產CPC的最佳培養基配方：水解葡萄糖添加量35 g/L，棕纖維素添加量46 g/L，玉米漿添加量38g/L。在最優條件下所產CPC效價的理論值為303.07U/mL，為上述研究中所產效價最高。為了驗證模型的可靠性，在最佳的培養基配方條件下進行3組搖瓶平行試驗，測定發酵液中CPC效價，得到的效價平均值為298.34 U/mL，與理論值（303.07 U/mL）的誤差僅為1.56%，表明試驗結果與此模型相符度高，能夠較好的預測實際發酵情況。

3 結論

該研究表明，利用廢棄的秸稈生物質經過SO3微熱爆預處理所得的棕纖維素，替代淀粉作為碳源發酵生產頭孢菌素C是完全可行的。

采用響應面法優化，得到最佳發酵培養基組成為：水解葡萄糖35 g/L、棕纖維素46 g/L、玉米漿38 g/L、纖維素酶0.8%、豆油25 g/L、硫酸銨10 g/L，在此條件下，CPC效價達298.34 U/mL，效價為標準發酵培養基的96.69%。