兼香型年份酒中香味物質的分析

周 容，袁 琦，晉湘宜，張 玉，陳茂彬，方尚玲*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068；2.湖北省釀造工藝與裝備工程技術中心，湖北武漢 430068）

在中國白酒的組成成分中，乙醇和水約占98%～99%，僅有1%～2%為微量成分，而白酒的質量和口味就由這部分微量物質所決定[1]。由于白酒中微量物質的種類和含量的不同[2]，導致中國白酒在香型和風格上差異很大，因此將中國白酒分為濃、清、米、醬、兼等香型[3]。其中濃香型[4]、醬香型[5]、清香型[6]和芝麻香型[7]等白酒中的香味物質都被廣泛研究，而有關兼香型白酒中香味物質的分析報道很少。

兼香型白酒是指帶有兩種及以上香型風格特征的產品，是多種香型白酒的綜合感官的協調體現。白云邊酒是濃醬兼香型白酒的典型代表，既具有醬香型白酒的幽雅細膩又有濃香型白酒的回味爽凈。然而，目前對兼香型白酒的研究主要集中于大曲、微生物多樣性及功能[8-9]等方面，對其香味物質研究很少。

在白酒的前處理技術中，如攪拌棒吸附萃?。╯tir bar sorptive extraction，SBSE）、液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）、同時蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）和頂空-固相微萃?。╤ead space solid-phase micro-extractions，HS-SPME）等技術都常用于白酒香味物質的提取。LLE通常需要有機溶劑[10]，SDE操作時間冗長[11]，SBSE[12]所需成本昂貴且工藝復雜。相比之下，HS-SPME因無溶劑、耗時短、成本低、簡單安全，可以將取樣、富集、解吸和進樣組合成一個步驟等優勢而更廣泛地用于白酒香味物質的提取[13]。此外，氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀作為一種成熟的檢測器，可以準確快速地分離和確定目標物，已廣泛地應用于白酒行業揮發性物質的分析[14]。因此，本研究采用HS-SPME結合GC-MS聯用技術，研究兼香型年份酒中揮發性香味成分含量及其變化，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA），比較年份酒之間的差異，以期為兼香型白酒中香味物質的分析提供理論與實踐指導，進而探索白酒中香味物質的形成機理。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

5種白云邊酒[分別為3年（3 Y），5年（5 Y），12年（12 Y），15年（15 Y）和20年（20 Y）酒精度均為42%vol]：湖北白云邊酒業股份有限公司。

丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、3-甲基丁醇等26種標品、乙酸正戊酯（內標）、無水乙醇（純度均＞97%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

50/30m DVB/CAR/PDMS萃取纖維：上海安譜實驗科技股份有限公司；85-2A恒溫磁力攪拌器：湖南前沿科技有限公司；DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、7890B-5977B氣相色譜質譜聯用儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香味物質的提取

準確稱量10 mL稀釋后的酒樣（酒精度14%vol）于30 mL頂空進樣瓶中并密封。在磁力攪拌器中40 ℃平衡20 min后用已老化好的萃取頭在頂空瓶液面上方（1～2 cm）富集20 min。最后在230 ℃的進樣口中解吸5 min并進樣。為防止樣品間相互污染，兩次進樣間萃取頭于240 ℃老化5 min。

1.3.2 GC-MS分析條件

GC條件：以氦氣（He）（純度99.999%）作為載氣，恒定流速為0.7 mL/min，采用不分流模式。柱箱升溫程序為45 ℃保持1.5 min，以6 ℃/min升至85 ℃，不保持，然后以4 ℃/min升至225 ℃，保持15 min。進樣口溫度230 ℃。MS條件：電子電離（electionic ionization，EI）源，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，質量范圍為30～550 m/z。

將質譜解析與美國國家標準技術研究所（national in stitute of standards and technology，NIST）14譜庫的比對結果進行初步定性（匹配度＞90%）、再與已有標樣的保留時間來進一步確認化合物結構。采用半定量法計算各物質含量。

1.3.3 模擬酒樣的制備

分別取一定量的26種標樣，以無水乙醇為溶劑定容于10 mL容量瓶中，得到標準儲備液；標準儲備液通過梯度稀釋得到標準工作液，上述標樣和溶液均在4 ℃保存備用。在乙醇溶液（酒精度14%vol）中加入一系列已知濃度的標準工作液制備成模擬酒樣，建立標準曲線進行方法評價。其中檢測限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）分別在3倍和10倍信噪比下計算，向樣品中添加一定量的標準工作液計算回收率。

1.3.4 重要香氣物質的確定

通過計算化合物的香氣活度值（aroma activity value，OAV）用來表征各化合物對香氣貢獻的大小。OAV的計算公式為：OAV=物質含量/物質閾值[15]。

通常認為OAV＞1的化合物對白酒香味有貢獻，而OAV＞10的化合物視為重要香氣物質。

2 結果與分析

2.1 萃取條件的優化

2.1.1 酒精度的選擇[16]

本實驗考察了酒精度（7%vol、14%vol、28%vol和42%vol（原酒樣））對香味成分的萃取效果，結果見圖1。

圖1 酒精度對香味物質總數量和總峰面積的影響Fig.1 Effect of alcohol content on the total quantity of aroma components and total peak area

由圖1可知，從化合物總峰面積和總出峰個數而言，酒精度為14%vol的酒樣均遠高于其他3種酒精度。表明酒精度對香味物質的提取影響很顯著。因此，選擇酒樣最適酒精度為14%vol。

2.1.2 萃取溫度的選擇[17-18]

本實驗對比了萃取溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃）對提取效果的影響，結果見圖2。

圖2 萃取溫度對香味物質總數量和總峰面積的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the total quantity of aroma components and total peak area

由圖2可知，總出峰個數和總峰面積在30～40 ℃時逐漸上升，并在萃取溫度40 ℃達到最多，但在40～50 ℃迅速下降，到60 ℃時吸附量波動很小。因此，選擇最適萃取溫度為40 ℃。

2.1.3 萃取時間的選擇[19]

本實驗研究了萃取時間為20 min、30 min、40 min和50 min的萃取結果，結果見圖3。

圖3 萃取時間對香味物質總數和總峰面積的影響Fig.3 Effect of extraction time on the total quantity of aroma components and total peak area

由圖3可知，萃取時間為20～30 min時，香味成分總數量和總峰面積隨萃取時間增加而增大，從30 min以后吸附量增長不明顯，說明吸附-解吸過程趨于平衡。因此，選擇最適萃取時間為30 min。

2.1.4 解吸時間的選擇[20]

本實驗對比較了5 min、10 min、15 min和20 min的解吸效果，結果見圖4。

由圖4可知，隨著解吸時間從5 min延長到20 min，物質的總峰面積和出峰個數幾乎都沒有增加，說明5 min的解吸時間已經足以將吸附物質完全解吸出來。考慮到萃取纖維的使用壽命和實驗效率，最佳解吸時間為5 min。

圖4 解吸時間對香味物質總數和總峰面積的影響Fig.4 Effect of desorption time on the total quantity of aroma components and total peak area

綜上，本實驗以酒樣酒精度為14%vol，萃取溫度為40 ℃，萃取時間為30 min，解吸時間為5 min確定為HS-SPME最佳操作參數。

2.2 方法驗證

通過可能有香氣貢獻的物質對優化方法進行評價，旨在檢驗該方法的可靠性，結果見表1。由表1可知，各標樣的線性相關系數（R2）除油酸乙酯（0.988 6）和正丁酸（0.986 7）外，其他標樣相關系數（R2）均＞0.991 6。LOD和LOQ分別為0.13～18.86 μg/L和0.42～63.59 μg/L，低于文獻報道值[21]。采用標準加入法對方法的回收率進行評價，除2-苯乙醇的加標回收率為77.8%外，其他物質的回收率為81.1%～115.3%，大部分都在80%～120%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均＜14.8%，表明此方法準確性和精密度良好，能應用于白酒香味成分分析中。

表1 方法的相關系數和線性范圍、定量限和檢測限、回收率和精密度Table 1 Correlation coefficients,linear ranges,LOQ,LOD,recovery rates and RSD of the method

2.3 年份酒的揮發性風味物質分析

采用已建立的HS-SPME結合GC-MS法對五種兼香型白酒中揮發性化合物進行分析，結果見表2。

由表2可知，共鑒定出67種化合物，包括50種酯類（含量80.25%），3種醇類（含量0.17%），5種酸類（含量19.33%），1種芳香族化合物（含量0.04%），1種含硫化合物（含量0.001%），2種呋喃類（含量0.05%），3種酮類（含量0.05%）和2種醛類（含量0.06%）。從化合物數量和含量上可以看出，酯類物質在兼香型白酒中最豐富，其次為酸類和醇類物質，其他物質相對較少。

表2 白云邊年份酒中67種風味成分分析結果Table 2 Analytical results of 67 flavor compounds in Baiyunbian aged Baijiu

續表

酯類主要呈現出花香和果香，在構成各白酒典型性中起著關鍵作用[22]，其種類和含量是白酒中最豐富的一類家族。兼香型白酒隨著年份的增加酯類含量明顯增加，3Y、5Y、12Y、15Y和20Y總酯含量分別為1598.13mg/L、1743.20mg/L、1 775.40 mg/L、1 808.13 mg/L和1 844.76 mg/L，說明酯類物質主要以酯化反應為主。其中己酸乙酯在3Y、5Y、12Y、15Y和20Y年中分別為1449.80mg/L、1547.43mg/L、1511.22 mg/L、1 535.82 mg/L和1 541.67 mg/L，在酯類物質中的含量最高。其次為丁酸乙酯和戊酸乙酯，含量分別在62.80～161.42 mg/L和33.98～59.62 mg/L范圍內。含量較高的酯類物質還有辛酸乙酯（10.05～23.59 mg/L）、己酸己酯（12.91～28.76 mg/L）、庚酸乙酯（7.89～15.23 mg/L）、丁酸乙酯和辛酸乙酯含量隨年份的增加而升高；戊酸乙酯和己酸己酯含量隨年份的增加先升高后降低，且二者都在12 Y中含量最高。

醇類作為白酒中的微量助香劑，使酒體香味獨特，對促進酒體豐滿醇厚和醇甜感濃郁起著關鍵作用[23]。本次實驗一共檢測出3種醇類物質，總醇含量在3 Y、5 Y、12 Y、15 Y和20 Y酒樣中分別為1.86 mg/L、1.23 mg/L、1.51 mg/L、7.95 mg/L和6.33 mg/L。3-甲基丁醇在酒體中含量最高，但僅在12 Y（5.64 mg/L）和15 Y（4.47 mg/L）中檢測出，在白酒發酵過程中脫氨基和脫羧反應產生的燃燒香味即由3-甲基丁醇產生[24]。此外，2-苯乙醇含量在五個年份酒中穩定在1.09～1.94 mg/L，也是白酒中重要的香氣物質，2-苯乙醇具有蜜香玫瑰味，使酒體具有清雅香氣和綿甜清爽之感[25]。辛醇含量最少且僅在3 Y、5 Y及15 Y中出現，其含量分別為0.19 mg/L、0.14 mg/L和0.37 mg/L。

酸類是促成白酒香味的主要貢獻者之一，也是酯類的前驅物質。大多數有機酸是在發酵過程中由細菌產生[26]。在酒樣中檢測到的總酸含量在3 Y、5 Y、12 Y、15 Y和20 Y酒樣中分別為277.56 mg/L、357.91 mg/L、480.74 mg/L、471.91 mg/L和523.65 mg/L，隨年份的增加呈上升趨勢。正己酸能產生溫和宜人的甜香和奶酪香[27]，其含量在酸類物質中最高（275.52～517.03 mg/L），呈增長趨勢。辛酸也呈上升趨勢，含量為1.28～4.98 mg/L。丁酸僅在20Y酒樣中發現，其含量為1.13 mg/L；而戊酸、庚酸等酸類含量都＜1 mg/L。

呋喃類在我國白酒中報道較多的是糠醛類物質，糠醛主要在白酒中產生澀味和焦香[28]。在兼香型白酒中檢測到兩種呋喃類物質，5-甲基-2-糠醛除了3 Y外，其他四個酒樣中都有被檢測，其含量分別為0.23 mg/L、0.40 mg/L、0.47 mg/L和0.68 mg/L。己酸糠酯含量隨年份呈上升趨勢，在3 Y、5 Y、12Y、15Y和20Y酒樣中分別為1.10mg/L、1.54mg/L、1.35mg/L、2.38 mg/L和2.48 mg/L。

芳香族化合物具有花香和蜂蜜芳香，其主要形成于原料中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸的降解[29]。如上文已介紹的少量2-苯乙醇的蜜香玫瑰味使酒具有清雅香氣和綿甜清爽之感，在五個樣品中分別檢測出1.67 mg/L、1.09 mg/L、1.51 mg/L、1.94 mg/L和1.86 mg/L。醛類物質賦予一種“香、爽”的口感，對白酒獨特性起著重要作用，濃度過高容易產生苦味[30]。與醛類相比較，酮類的香氣更為綿柔細膩，具有花香和果香。苯甲醛具有杏仁和焦糖的氣味，在醛酮類物質中含量最高，在3 Y、15 Y和20 Y中分別為1.21 mg/L、2.12 mg/L和1.90 mg/L。

隨著年份的增加，香氣成分從微妙動態變化到趨于穩定，使兼香型白酒濃醬協調、芳香優雅、綿厚爽甜、圓潤怡長、典型性突出。

白酒香味物質濃度并不能判斷其對香氣貢獻程度的大小，而是考察OAV的大小。參考香味化合物閾值[31]，對五種兼香型白酒香味成分進行OAV分析，結果見表3。由表3可知，己酸乙酯的OAV＞10 000，丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯和己酸己酯的OAV＞1 000，己酸、二甲基三硫的OAV＞100，十四酸乙酯、萘的OAV＞10。因此OAV＞10的化合物共9種，視為重要香氣物質。其中酯類占絕大部分，是白云邊年份酒中最重要的香氣成分。丁酸-3-甲基丁酯、庚酸乙酯、己酸丁酯、己酸異戊酯、辛酸-3-甲基丁酯、苯乙酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、丁酸、戊酸、辛酸2-壬酮、2-十一酮和壬醛的OAV均＞1，這13種成分視為對酒香味有貢獻。這22種香味物質賦予兼香型白酒突出的花香、果香、甜香、醇香等香味，其余物質OAV均＜1。

表3 兼香型年份酒中22種香味成分的香氣活度值Table 3 Odor activity values determined for 22 compounds in strong-sauce-flavor aged Baijiu

3 結論

建立了一種分析兼香型白酒香氣物質的HS-SPME的方法，最佳萃取條件為酒樣酒精度14%vol，萃取溫度40 ℃，萃取時間30 min，解吸時間5 min。LOD和LOQ范圍分別為0.13～18.86 μg/L和0.42～63.59 μg/L，大多數物質的回收率為81.1%～115.3%，RSD均＜14.8%。

在五種兼香型白酒中共鑒定出67種揮發性風味化合物，其中酯類、醇類、酸類和呋喃類總含量呈現上升趨勢，芳香類物質呈現先上升后略有下降趨勢，醛類、酮類化合物含量變化規律不明顯。隨著年份的增加，香氣成分從微妙動態變化到趨于穩定，使兼香型白酒濃醬協調、芳香優雅、綿厚爽甜、圓潤怡長、典型性突出。

確定出22種（OAV＞1）具有香味貢獻的物質，其中有9種為重要的香氣成分（OAV＞10），這22種香味物質賦予兼香型白酒突出的花香、果香、醇香、甜香等香味。為進一步分析兼香型白酒香味物質提供理論與實踐指導，進而探索白酒中香味物質的形成機理，對今后白酒的釀造生產，穩定并提高年份酒產品質量具有重要的意義。