響應面法優化弗氏葡糖桿菌PFY-8產胞外多糖發酵工藝

裴芳藝，薛 迪，馬巖石，劉宇超，劉得水，李 慧，劉 韓，陳 雪

（齊齊哈爾醫學院科研處，黑龍江齊齊哈爾 161000）

微生物胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是微生物在生長代謝過程中產生并分泌到細胞壁外的天然大分子物質，具有重要的生物活性功能，廣泛應用于食品和醫藥等領域[1-2]。研究表明，微生物EPS可作為食品穩定劑和增稠劑，增加食品黏度防止乳清沉淀[3]，可作為益生元添加到保健食品中，調節腸道菌群平衡[4-5]，可作為添加劑添加到藥品中，達到提高機體免疫力、降低膽固醇、抗腫瘤和抗氧化的作用[6-7]。目前用于生產EPS的微生物主要為乳酸菌中的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）[8-9]、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[10-11]、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）[12]和魏斯氏菌屬（Weissellasp.）[13-14]等。葡糖桿菌屬（Gluconobactersp.）作為一類具有產EPS能力的微生物，近些年來也逐漸受到人們的關注，但受其產量的制約，很難應用到大規模的工業化生產中。因此，對其產EPS條件的優化成為研究的熱點[15-16]。

利用微生物發酵生產EPS，需要多種營養成分和環境因素共同作用，各種因素間的相互作用錯綜復雜，具有高度的非線性[17-18]。因此，在微生物發酵產EPS過程中，優化培養基成分和發酵條件對發酵水平的提高起著舉足輕重的作用，而在尋求最佳發酵培養基和發酵條件的過程中，試驗設計及統計優化發揮著重要作用[19]。目前針對培養基和發酵條件的優化主要采用單因素試驗、正交試驗設計和響應面法（response surface methodology，RSM）優化等方法[20]。RSM主要用于研究反應混合物中各組分所占比例與其產物生物學活性和含量之間的關系，確定最優試驗條件[21]，已經成為優化加工條件、降低開發成本和提高產品質量的一種有效方法，同時也成為一種快速優化培養基和發酵條件的方法，廣泛地應用于生物、食品和化學等領域[22]。

本研究以分離自自然發酵草莓汁中的弗氏葡糖桿菌（Gluconobacter frateurii）PFY-8為試驗菌株，以EPS含量為響應值，采用單因素試驗和RSM方法優化培養基組成和培養條件，旨在進一步提高EPS的產量，為進一步利用G.frateuriiPFY-8大量生產EPS提供依據，同時也為其EPS分離純化、結構分析和功能研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株弗氏葡糖桿菌（Gluconobacter frateurii）PFY-8：分離自自然發酵的草莓汁中，甘油管保存于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、蔗糖、半乳糖、木糖、D-阿拉伯糖、醋酸鈉（CH3COONa）、硫酸錳（MnSO4）、硫酸鉀（K2HPO4）、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、檸檬酸銨、吐溫-80、苯酚、硫酸、三氯乙酸（均為分析純）：天津市江天化工技術有限公司；牛肉浸膏、蛋白胨、酵母提取物（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.3 培養基

MRS培養基：葡萄糖20 g/L，牛肉浸粉10 g/L，酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，CH3COONa 5 g/L，K2HPO42 g/L，MnSO40.25g/L，MgSO4·7H2O0.58g/L，檸檬酸銨2g/L，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；BSC-1100-LⅡ-A2生物安全柜：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；HZQ-211C落地振蕩器、DHP-9162電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；AL204電子天平、FE28pH計：梅特勒-托利多集團；22331Hamburg高速離心機、5804R臺式高速大容量冷凍離心機：德國艾本德公司；V-5000可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株活化

取甘油保藏的G.frateuriiPFY-8菌株20 μL接種于30 mL MRS培養基中，30 ℃、120 r/min培養48 h，再按2%（V/V）的接種量接種于MRS培養基，30 ℃、120 r/min培養24 h，活化3代后，用于后續試驗。

1.3.2 EPS的提取

多糖的提取參照DU R P等[12]的方法。將活化后的G.frateuriiPFY-8菌株以2%（V/V）接種量接種到MRS培養基中，30 ℃、120 r/min振蕩培養48 h。4 ℃、11 000 r/min離心20 min去除菌體。加入上清液3倍體積分數95%的乙醇，4 ℃靜置24 h，按上述條件離心收集沉淀，用適量去離子水溶解多糖沉淀，加入等體積的10%三氯乙酸，充分攪拌，4 ℃靜置24h后離心。上清液中加入3倍體積分數95%的乙醇，4℃靜置24 h，按上述條件離心，多糖沉淀溶于50 mL去離子水中，裝入透析袋，4 ℃透析2 d，每8 h換一次水，獲得粗胞外多糖（EPS）。

1.3.3 EPS含量的測定[23-24]

通過苯酚-硫酸法測定EPS的含量，以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得到葡萄糖標準曲線回歸方程為：y=9.855x+0.009，相關系數R2=0.999。根據標準曲線回歸方程計算菌株產EPS的含量。

1.3.4 培養基優化單因素試驗

分別在MRS培養基中添加蔗糖、半乳糖、木糖、D-阿拉伯糖（20 g/L），考察不同碳源對EPS產量的影響；選取最有利于菌株產EPS的碳源，分別考察添加量為20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L、100 g/L、120 g/L、140 g/L碳源時EPS的產生情況；向優化后的培養基中，分別加入不同添加量牛肉浸粉（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）、酵母提取物（0、2 g/L、4 g/L、6 g/L、8g/L、10 g/L）和蛋白胨（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L），考察不同添加量有機氮源對EPS產量的影響；向優化后的培養基中，分別加入添加量為0、1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L、4.0g/L、5.0 g/L的檸檬酸銨，考察不同添加量檸檬酸銨對EPS產量的影響。

1.3.5 培養條件優化單因素試驗

分別選擇培養溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）、轉速（0、60 r/min、120 r/min、180 r/min、240 r/min）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、培養時間（24 h、48 h、72 h、96 h、120 h）、初始pH值水平（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5）條件下測定菌株產EPS的含量，確定其最佳培養條件。

1.3.6 Plackett-Burman（PB）試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇影響EPS產量的7個因素（蔗糖添加量、蛋白胨添加量、檸檬酸銨添加量、培養溫度、轉速、培養時間、初始pH值），以EPS產量（Y）為響應值，將每個因素分為高（+1）、低（-1）2個水平，共進行15組試驗。PB試驗設計因素與水平見表1。

表1 PB試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of PB experiments design

1.3.7 響應面試驗設計

根據PB試驗結果，以EPS產量（Y）為響應值，對影響因素蔗糖添加量（X1）、轉速（X5）、初始pH值（X7），進行中心組合試驗設計（central composite design，CCD），得到最優方案。CCD試驗設計因素與水平見表2。

控制系統加入前饋補償功能后，一旦出現LNG流量或者壓力的擾動，前饋調節器就根據擾動的大小補償對被控量的影響。只要前饋函數設置相對合理，實現近似補償是可行的。

表2 中心組合試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of central composite experiments design

1.3.8 數據統計分析

響應面試驗設計使用Design Expert 8.0.6；統計分析使用SPSS 19.0；繪圖使用Excel 2016。

2 結果與分析

2.1 培養基成分對菌株產EPS的影響

2.1.1 碳源種類對EPS產量的影響

EPS產量不僅受菌體自身遺傳因素的影響，而且培養基組成（碳源、氮源）和培養條件也會對菌株EPS產量造成很大影響[25]。因此，可通過優化培養基成分來提高菌株產EPS的能力。由圖1可知，G.frateuriiPFY-8可利用多種碳源合成EPS，其中蔗糖作為碳源時，EPS產量最高，為（12.90±0.41）g/L，其次是半乳糖（9.42±0.56）g/L、木糖（7.78±0.43）g/L、D-阿拉伯糖（5.92±0.43）g/L。因此，選擇最佳碳源為蔗糖。

圖1 不同碳源對菌株PFY-8胞外多糖產量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on exopolysaccharide production of strain PFY-8

圖2 蔗糖添加量對菌株PFY-8胞外多糖產量的影響Fig.2 Effect of sucrose addition on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.1.2 蔗糖添加量對EPS產量的影響蔗糖添加量對EPS產量的影響見圖2。由圖2可知，隨著蔗糖添加量的增加，EPS產量呈現先增加后減少的趨勢，在蔗糖添加量為80 g/L時，G.frateuriiPFY-8的EPS產量最高，為（25.60±0.34）g/L，是蔗糖添加量為20 g/L的1.95倍。說明在MRS培養基中加入一定添加量的蔗糖，可以大幅度提高EPS的產量。因此，選擇最佳蔗糖添加量為80 g/L。

2.1.3 有機氮源添加量對EPS產量的影響

圖3 牛肉浸粉（A）、酵母提取物（B）及蛋白胨（C）添加量對菌株PFY-8胞外多糖產量的影響Fig.3 Effect of beef extract (A),yeast extract (B) and peptone (C)addition on exopolysaccharide production of strain PFY-8

由圖3可知，隨著氮源添加量的增加，EPS的產量均呈現先增加后減少的趨勢，當牛肉浸膏、酵母提取物、蛋白胨添加量分別為10 g/L、8 g/L、15 g/L時，發酵液中EPS產量最高，分別為（25.40±0.56）g/L、（28.94±0.38）g/L、（30.19±0.45）g/L。因此，選擇最佳牛肉浸膏、酵母提取物、蛋白胨添加量分別為10 g/L、8 g/L、15 g/L。

2.1.4 檸檬酸銨添加量對EPS產量的影響

檸檬酸銨添加量對EPS產量的影響結果見圖4。由圖4可知，隨著檸檬酸銨添加量的增加，EPS的產量呈現先增加后減少的趨勢，當檸檬酸銨添加量為3 g/L時，G.frateuriiPFY-8的EPS產量最高，為（31.10±0.32）g/L。因此，選擇最佳檸檬酸銨添加量為3 g/L。

圖4 檸檬酸銨添加量對菌株PFY-8胞外多糖產量的影響Fig.4 Effect of ammonium citrate addition on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.2 發酵條件對菌株產EPS的影響

培養溫度對菌株G.frateuriiPFY-8產EPS影響結果見圖5。由圖5可知，隨著培養溫度的升高，EPS的產量呈現先升后降趨勢，當培養溫度為25 ℃時，EPS產量最高，為（32.06±0.66）g/L。可能是因為過高的培養溫度不僅影響菌株生長，還會降低合成EPS酶的活性，從而降低菌株生產EPS的量。因此，選擇最佳培養溫度為25 ℃。

2.2.2 轉速對EPS產量的影響

轉速主要影響培養基的溶氧量，菌株G.frateuriiPFY-8為嚴格好氧菌[26]，因此，研究發酵過程中轉速對EPS合成的影響極為重要。轉速對菌株G.frateuriiPFY-8產EPS影響結果見圖6。由圖6可知，在一定范圍內隨著轉速的增加，EPS含量增加，當搖床轉速為120 r/min時，EPS的含量最高，為（31.15±0.47）g/L。當搖床轉數較低時，單位時間內培養液的溶氧量較低，菌體的生長速度和EPS生成速率下降，隨著搖床轉速的不斷增加，菌體生長速度和EPS合成速度增加。但當轉速超過一定范圍時，由于剪切力過大，破壞菌體結構，使菌體過早衰亡，反而降低EPS產量[27]。因此，選擇最佳搖床轉速為120 r/min。

圖6 轉速對菌株PFY-8胞外多糖產量的影響Fig.6 Effect of rotation speed on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.2.3 接種量對EPS產量的影響

接種量對菌株G.frateuriiPFY-8產EPS的影響結果見圖7。由圖7可知，隨著接種量的增加，菌株產EPS的含量呈現先增加后降低的趨勢。當接種量為9%時，EPS產量最低，為（29.04±0.208）g/L，這說明過大的接種量，使培養基內的營養物質加速消耗，導致合成EPS的前體物質減少，反而降低EPS產量[28]。當接種量為5%時，EPS含量最高，為（4.10±0.08）g/L。因此，菌株的最適接種量為5%。

圖7 接種量對菌株PFY-8胞外多糖產量的影響Fig.7 Effect of inoculum on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.2.4 培養時間對EPS產量的影響

培養時間對菌株G.frateuriiPFY-8產EPS影響結果見圖8。由圖8可知，在一定時間內，隨著培養時間的延長，EPS含量逐漸增加，培養時間為96 h時，EPS含量最高，可達到（34.33±0.31）g/L。但超過一定范圍后，EPS含量開始下降，可能由于培養成分的消耗，阻礙了菌株的正常生長，進而影響了EPS的生成[29]。因此，選擇最佳培養時間為96 h。

圖8 培養時間對菌株PFY-8胞外多糖產量的影響Fig.8 Effect of culture time on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.2.5 初始pH值對EPS產量的影響

菌株生長和EPS的合成需在最適的pH值條件下進行，pH值可影響菌體細胞膜的功能、細胞的形態和細胞對營養物質的代謝[30]。初始pH值對菌株G.frateuriiPFY-8產EPS影響結果見圖9。由圖9可知，過高和過低的初始pH值均不利于菌株G.frateuriiPFY-8合成EPS，當初始pH值為5.5時，EPS產量最高，為（36.75±0.47）g/L，說明偏酸性環境有利于菌株EPS的積累。因此，選擇最佳初始pH值為5.5。

圖9 初始pH值對菌株PFY-8胞外多糖產量的影響Fig.9 Effect of initial pH value on exopolysaccharide production of strain PFY-8

2.3 PB試驗分析

在單因素試驗基礎上，篩選出對EPS影響較為顯著的因素，進行PB試驗。PB試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

由表4可知，模型F值為23.48，P值為0.004 3＜0.01，說明試驗模型具有顯著性。相關系數R2=0.976 2，說明存在97.62%的試驗數據可用該模型解釋，調整相關系數R2=0.934 7，二者均接近1，說明預測值與試驗值之間相關度高，可以用該模型模擬菌株EPS的發酵過程。信噪比=16.198（＞4），證明該模型可以很好的擬合試驗數據。各變量對EPS影響顯著程度依次為X1＞X7＞X5＞X4＞X2＞X6＞X3，即蔗糖添加量、轉速和初始pH值對菌株產EPS影響極顯著（P＜0.01）。因此，進一步選擇蔗糖添加量（X1）、轉速（X5）和初始pH值（X7）進行響應面試驗。

表3 PB試驗設計與結果Table 3 Design and results of PB experiments

表4 PB試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of PB experiments results

2.4 響應面試驗分析

在PB試驗基礎上，選擇蔗糖添加量（X1）、轉速（X5）和初始pH值（X7）為影響因子，EPS產量（Y）為響應值，響應面試驗結果見表5，方差分析結果見表6。

由表6可知，回歸模型的F值為2 632.15，P＜0.000 1，決定系數R2=0.999 6，調整決定系數R2=0.999 2，信噪比=138.977（＞4），變異系數（coefficient of variation，CV）=0.18%，說明試驗精確度和準確度高。模型失擬項P=0.164 8＞0.05，說明所選模型擬合性較好，無其他顯著性影響因素。因此，可以判斷CCD是可靠的，該模型可以較好的應用于G.frateuriiPFY-8合成EPS的理論預測。一次項（X1、X5、X7）和二次項（X12、X52、X72）對菌株產EPS有極顯著影響（P＜0.01），交互項（X1X5、X5X7）對菌株產EPS有顯著影響（P＜0.05），交互項（X1X7）對菌株產EPS無顯著影響（P＞0.05）。

表5 中心組合試驗設計與結果Table 5 Design and results of central composite experiments

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

根據響應面試驗結果，得到模型擬合方程如下：

各因素之間的交互作用對G.frateuriiPFY-8產EPS影響的響應面圖見圖10。

圖10 蔗糖添加量、轉速和初始pH值對菌株PFY-8產胞外多糖影響的響應面及等高線Fig.10 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between sucrose addition,rotation speed and initial pH value on exopolysaccharide production of strain PFY-8

由圖10A可知，當初始pH值為5.5時，蔗糖添加量和轉速的交互作用對EPS的合成影響顯著。由圖10B可知，當轉速為120 r/min時，蔗糖添加量和初始pH值的交互作用對EPS的合成影響不顯著。由圖10C可知，當蔗糖添加量為80 g/L時，轉速和初始pH值的交互作用對EPS的合成影響顯著。蔗糖添加量、轉速和初始pH值三者之間有較明顯的交互作用，其交互作用強弱的順序為X1X5＞X5X7＞X1X7。

2.5 驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6軟件求解方程，得出預測的最優條件為蔗糖添加量86.11 g/L、轉速125.92 r/min和初始pH值5.55，在該條件下EPS產量預測值為36.86 g/L。為后續試驗方便，將擬合最優條件修正為蔗糖添加量86g/L、轉速130r/min、初始pH值5.6。為檢測擬合結果的可信度，采用修正后的條件進行驗證試驗，測得G.frateuriiPFY-8的EPS產量實際值為（37.07±0.38）g/L，與預測值無顯著差異（P＞0.05），是優化前的1.55倍。

3 結論

為提高菌株G.frateuriiPFY-8的EPS產量，本研究聯合采用單因素試驗和RSM法，建立菌株G.frateuriiPFY-8發酵EPS的多項式模型，確定其最佳培養基為葡萄糖20 g/L，蔗糖86 g/L，牛肉浸膏10 g/L，酵母提取物8 g/L，蛋白胨15 g/L，CH3COONa 5 g/L，K2HPO42 g/L，MnSO40.25 g/L，檸檬酸銨3 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，吐溫-80 1 mL/L。最佳培養條件為培養溫度25 ℃、搖床轉速130 r/min、接種量5%、培養時間96 h、初始pH值5.6。在此優化條件下，G.frateuriiPFY-8的EPS產量為（37.07±0.38）g/L，是優化前的1.55倍。本研究為進一步利用G.frateuriiPFY-8大量生產EPS提供理論依據，同時也為其EPS分離純化、結構分析和功能研究提供理論支持。