基于MiSeq測序技術石花酒大曲中微生物多樣性解析

薛宇昂，郭 壯，趙慧君，張振東，雷 敏*

（1.湖北文理學院食品科學技術學院鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北襄陽 441053；2.石河子大學食品學院，新疆石河子 832003）

石花酒是用高粱、糯米為原料，以豌豆、大麥制曲，進行地缸發酵、分段取酒，最后勾兌而成的清香型白酒，是湖北省名酒之一。大曲中豐富的微生物菌落是酒體風味品質形成的關鍵因素。近年來，研究人員對全國各類大曲中微生物多樣性展開了廣泛的研究。劉桂君等[1]從牛欄山酒廠清香型大曲和酒醅中分離出23株芽孢桿菌，通過生理生化試驗鑒定12株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；李增勝[2]研究發現，汾酒酒醅中的酵母菌以酵母菌屬（Saccharomyces）為主，其產酒精能力最強，其次是具有一定產香和產酒精能力的漢遜酵母（Hansenula）和假絲酵母（Candida）及產酒精不強的擬內孢霉（Endomycopsis），還有極少量的畢赤酵母（Pichia）等產膜酵母；蘭玉倩等[3]利用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）指紋技術分析了清香型大曲在生產過程中酵母類微生物的演替規律。共檢測到伊薩酵母屬（Issatchenkia）、畢氏酵母（Pichia）、酵母菌屬（Saccharomyces）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、地霉屬（Geotrichum）和根霉屬（Rhizopus）6個真菌微生物屬，其中東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）在大曲整個生產過程中占絕對優勢；王彩虹[4]采用克隆文庫技術與PCR-限制性片段長度多態性（restricted fragment length polymorphisms，RFLP）技術相結合的手段研究發現，3種汾酒清香型大曲中細菌均分布于芽孢桿菌綱（Bacillibacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）及變形菌綱（Alphaproteobacteria），且3種大曲的優勢細菌群均含有乳桿菌屬。以上研究成果為酒曲中優勢菌種的開發及進一步深入研究的開展奠定了良好的基礎。石花酒大曲（以下簡稱石花大曲）中微生物豐富，群落結構復雜，種類繁多，然而目前未有關于石花大曲微生物多樣性研究的報道。

下一代測序（next generation sequencing，NGS）一方面可快速準確地提供高通量測序信息，另一方面可為分析提供定位結果[5]，其中Illumina MiSeq高通量測序技術已被廣泛應用于各項研究中。HU X L等[6]使用Illumina MiSeq對濃香型白酒窖泥微生物信息進行測序分析，結果表明，窖泥微生物群落與窖泥品質和環境因素有關。YANG H Y等[7]根據Illumina MiSeq測序分析發現，東北地區酸菜發酵的過程中出現了硬桿菌、變形桿菌、擬桿菌、放線菌、藍藻、梭桿菌和疣菌，以及其他未分類的細菌；沈馨等[8]利用Illumina MiSeq高通量測序技術發現，孝感地區3個鳳窩酒曲共有大量的核心細菌菌群；POLKA J等[9]利用Illumina MiSeq測序在意大利蒜味咸腸中鑒定出32種不同的葡萄球菌和33種乳酸桿菌，其中23個存在于至少10%的調查樣品中。綜上，Illumina MiSeq高通量測序技術能夠更準確全面地獲取樣品中微生物群落結構信息。

本研究以采集自湖北襄陽市石花酒廠的石花大曲為研究對象，提取樣品宏基因組，采用Illumina MiSeq高通量測序技術對其微生物多樣性進行解析，以期為石花大曲中微生物資源的開發奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

石花大曲：襄陽石花酒廠；采集自湖北襄陽市石花酒廠，4個樣品分別命名為SHQ01、SHQ02、SHQ03、SHQ04。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTPs）Mix、5×TransStartTM、FastPfu Buffer和FastPfu Fly脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）Polymerase（5 U/μL）：北京全式金生物技術有限公司；10×PCR Buffer、Solution I、pMD18-T vector、蛋白酶K（20 U/μg）、溶菌酶（400 U/μg）：寶生物工程（大連）有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒：德國QIAGEN公司；乙二胺四乙酸二鈉、十二烷基硫酸鈉、氯仿、十六烷基三甲基溴化銨、異丙醇、乙醇、三輕甲基氨基甲烷、酚、異戊醇、氯化鈉和乙酸鈉等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國NanoDrop公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統：美國BIO-RAD公司；Vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；R920機架式服務器：美國DELL公司；Miseq高通量測序平臺：美國Illumina公司；2100芯片生物分析儀：美國Agilent公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

將采集到的石花大曲樣品置于有干冰的采樣箱中于24 h內運回實驗室，使用潔凈無菌的研缽研成粉末后使用。

1.3.2 石花大曲中微生物宏基因組DNA提取

使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒提取石花大曲樣品中的微生物總DNA，并用微量紫外分光光度計檢測提取的DNA純度及濃度，以此獲得高品質和高濃度的微生物宏基因組DNA。

1.3.3 細菌和真菌PCR擴增

按文獻[10]所述方法對樣品中細菌16S rRNA的V3-V4區進行PCR擴增。按文獻[11]所述方法對樣品中真菌18SrRNA的V4-V5區進行PCR擴增。用1%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行檢測[12]，利用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒將其回收并送樣至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumian MiSeq高通量測序，測序平臺為Illumian MiSeq PE300。

1.3.4 序列的拼接及質控

按照文獻[13]所述的方法進行序列拼接，按照序列間的重疊關系對Illumian MiSeq PE300平臺獲取的數據進行拼接，在拼接過程中要求重疊區的堿基數≥10 bp或最大錯配比率≤0.2，同時要求引物堿基錯配數≤2 bp，且切除引物后序列的長度＞50 bp，若序列不符合上述條件則予以剔除。

1.3.5 生物信息統計與分析

使用QIIME（quantitative insights into microbial ecology）平臺[14]進行物種鑒定和相對含量的分析；使用PyNAST工具[15]校準并排齊序列；使用UCLUST算法[16]分別以100%和97%的相似度進行序列劃分并建立操作分類單元（opera tionaltaxonomicunits，OTU），從每個OTU中選出代表性序列，分別整合核糖體數據庫（ribosomal database project，RDP）[17]、Greengenes[18]和SILVA數據庫[19]，對OTU進行序列同源性比對和種屬分類學鑒定，從而分別明確石花大曲中細菌和真菌的相關信息。利用觀察物種（Observed Species）指數、超1（Chao 1）指數、香農（Shannon）指數和辛普森（Simpson）指數等評價微生物菌群的豐度和多樣性[20]。

1.3.6 圖像繪制與數據處理

使用Matlab2016b軟件進行熱圖的繪制，其他圖由Origin 8.5軟件繪制。相關性由SAS V8軟件分析。

2 結果與分析

2.1 石花大曲樣品細菌序列豐富度分析

使用Illumian MiSeq高通量測序技術對4個石花大曲樣品的細菌多樣性進行分析，其16S rRNA測序結果及多樣性指數見表1。其中Observed Species指數和Chao 1指數是估算樣品中含有物種數目及所含OTU數目的指數，兩者均能反映樣品的物種豐度，Shannon指數和Simpson指數用來表現樣品中物種的豐富度和均勻度，兩者均能反映樣品的物種多樣性。

表1 石花酒大曲樣品中細菌的測序結果及多樣性指數Table 1 Sequencing results and diversity index of bacteria in Shihua Baijiu Daqu samples

由表1可知，4個石花大曲樣品中共產生246 873條細菌序列，平均每個樣品產生61 718條序列。根據97%相似性歸類共得到8 180個OTU，平均每個樣品2 045個OTU。當測序量為54 010時，樣品SHQ04的Observed Species指數、Chao 1指數、Shannon指數和Simpson指數均為各樣品中的最大值，分別為1 189、1 257、6.27和0.96，表明樣品SHQ04中細菌群落豐富度和多樣性均為最高；樣品SHQ02的Observed Species指數、Chao 1指數、Shannon指數和Simpson指數均為最小，分別為779、912、3.80和0.74，表明樣品SHQ02中細菌群落豐富度和多樣性均為最低。

2.2 基于門和屬水平的細菌多樣性分析

圖1 基于細菌門（A）和屬（B）水平石花酒大曲樣品中細菌多樣性分析Fig.1 Analysis of bacteria diversity in Shihua Baijiu Daqu samples based on the phylum (A) and genus (B) level

從每個OTU中挑選一條代表性序列進行比對，然后統計其界、門、綱、目、科和屬的種類和數量，其中細菌門及屬的分析結果見圖1，將相對含量＜0.1%的細菌門或相對含量＜0.1%的細菌屬歸為其他，相對含量＞0.1%的細菌門或相對含量＞1%的細菌屬定義為優勢細菌門或屬。

由圖1A可知，4個石花大曲樣品中共檢測出17個細菌門，其中優勢細菌門為變形桿菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria），平均相對含量分別為61.33%、32.25%、5.04%，且平均僅有0.1%的菌株不能鑒定到門水平。樣品中變形桿菌門和厚壁菌門的累積平均相對含量高達93.58%，而放線菌門平均相對含量＜5.04%。樣品SHQ04中變形桿菌門的相對含量明顯低于其他樣品，而樣品SHQ02中厚壁菌門含量亦明顯低于其他樣品，說明各樣品中細菌門的種類和含量存在差異。

由圖1B可知，4個石花大曲樣品中共檢測出168個細菌屬，其中優勢細菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和Kroppenstedtia，平均相對含量分別為58.97%、12.98%、12.86%、3.71%、1.83%、1.27%和1.25%，所有合格序列僅有1.70%不能鑒定到屬水平。值得一提的是，假單胞菌屬在樣品SHQ04中的相對含量僅有6.51%，而在樣品SHQ02中的相對含量高達95.33%；乳桿菌屬在樣品SHQ04中的相對含量為47.88%，而在樣品SHQ01、SHQ02和SHQ03中的相對含量分別為3.37%，0.07%和0.13%；明串珠菌屬僅在樣品SHQ1和SHQ4中含有。由此可見，雖然石花大曲樣品中含有大量細菌菌群，但這些優勢細菌在各樣品中并非均勻分布。陳申習等[21]采用傳統分離方法和現代分子技術對清香型小曲白酒機械化生產中微生物動態變化進行了研究，發現酒醅微生物的細菌主要為乳桿菌屬和芽孢桿菌屬。也有研究人員采用高通量測序技術對清香型白酒發酵過程中的細菌多樣性進行了解析。張雙燕等[22]利用高通量測序方法對北京某清香型酒廠大曲細菌進行分析，發現厚壁菌門為優勢菌門；乳桿菌屬、片球菌屬（Pediococcus）、乳球菌屬（Factococcus）、明串珠菌屬為優勢菌屬；王雪山等[23]利用高通量測序技術分析不同位置酒醅中微生物種群結構及演替規律，發現清香型白酒發酵過程中優勢細菌種群包括乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、Kroppenstedtia、假單胞菌屬、明串珠菌屬、芽孢桿菌屬和片球菌屬。上述結論中均有優勢屬乳桿菌屬，其他屬在結論中也有重復出現，結論中略微不同的原因可能是與使用原料、制作環境或制作工藝有關。

2.3 基于OTU水平的細菌多樣性分析

4個石花大曲樣品中的OTU數量及種類并非完全相同，其中平均相對含量＞1%的OTU有9個，其在各石花大曲樣品中的相對含量見圖2。

圖2 石花酒大曲樣品中平均相對含量＞1%細菌OTU統計分析Fig.2 Statistical analysis of OTU of bacteria with mean relative content more than 1% in Shihua Baijiu Daqu samples

由圖2可知，平均相對含量＞1%的OTU（平均相對含量）分別為OTU5 932（29.43%）、OTU9（11.79%）、OTU1 837（10.63%）、OTU6 068（3.49%）、OTU5 659（2.60%）、OTU3 353（2.29%）、OTU4 058（1.22%）、OTU895（1.10%）和OTU5 687（1.05%），其中OTU5 932、OTU9、OTU895和OTU5 687隸屬于變形桿菌門，OTU1837、OTU6068和OTU5659隸屬于厚壁菌門，OTU3353和OTU4058隸屬于放線菌門，且除OTU4058，其他OTU在各樣品中均存在。由圖2亦可知，樣品SHQ2中OTU5 932的相對含量已達65.15%，顯著高于其他樣品，而其OTU2 793的相對含量僅為2.09%，樣品SHQ4中OTU6 068的相對含量已達32.25%，顯著高于其他樣品，且OTU4 058僅在樣品SHQ4中出現。在每個樣品中均出現的細菌門為樣品的核心細菌門。由此可見，石花大曲樣品中的核心細菌門為變形桿菌門、厚壁菌門和放線菌門，且各樣品相對含量存在差異。

2.4 石花大曲樣品真菌序列豐富度分析

使用Illumian MiSeq高通量測序技術對4個石花大曲樣品的真菌多樣性進行分析，其18S rRNA測序結果及多樣性指數見表2。

由表2可知，4個石花大曲樣品中共產生179 736條真菌序列，平均每個樣品產生44 934條序列。根據97%相似性歸類共得到4 640個OTU，平均每個樣品1 160個OTU。當測序量為42010時，樣品SHQ02的ObservedSpecies指數、Chao 1指數、Shannon指數和Simpson指數均為各樣品中的最大值，分別為1 275、5 478、4.69和0.90，表明樣品SHQ02中真菌群落豐富度和多樣性均最大；樣品SHQ01的Observed Species指數和Chao 1指數最小，分別為1 000和3 083，樣品SHQ04的Shannon指數和Simpson指數最小，分別為2.93和0.51。表明樣品SHQ01中真菌群落豐富度最低，SHQ04多樣性最低。

表2 石花酒大曲樣品中真菌的測序結果及多樣性指數Table 2 Sequencing results and diversity index of fungi in Shihua Baijiu Daqu samples

2.5 基于門和屬水平的真菌多樣性分析

從每個OTU中挑選一條代表性序列進行比對，然后統計其界、門、綱、目、科和屬的種類和數量，其中真菌門及屬水平的分析結果見圖3，將相對含量＜0.1%的真菌門或相對含量＞1%的真菌屬歸為其他，相對含量＞0.1%的真菌門或相對含量＞1%的真菌屬定義為優勢真菌門或屬。

由圖3A可知，4個石花大曲樣品中主共檢測出3個真菌門，其中優勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota）、其他的真菌門有擔子菌門（Basidiomycota）和Mucoromycota，平均相對含量分別為99.70%、0.17%、0.12%，且平均僅有0.01%不能鑒定到門水平。樣品中子囊菌門的平均相對含量高達99.70%，而擔子菌門和Mucoromycota的累計平均相對含量＜0.29%。樣品SHQ04中擔子菌門和Mucoromycota的相對含量明顯低于其他樣品，而樣品SHQ02中子囊菌門含量低于其他樣品，說明各樣品中真菌門的種類和含量存在差異。

由圖3B可知，4個樣品中共檢測出25個真菌屬，其中優勢真菌屬為復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、紅曲菌屬（Monascus）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和Leiothecium，平均相對含量分別為57.08%、17.58%、5.38%、4.76%、1.78%和1.22%，所有合格序列有8.47%不能鑒定到屬水平。值得一提的是，復膜孢酵母屬在樣品SHQ02中的相對含量僅有21.25%，而在樣品SHQ04中的相對含量高達88.39%；青霉菌屬在樣品SHQ02中的相對含量為18.58%，而在樣品SHQ01、SHQ03和SHQ04中的相對含量分別為0.13%、0.34%和0.01%；紅曲菌屬在樣品SHQ4中僅含有0.04%。由此可見，雖然石花大曲樣品中含有大量真菌菌群，但這些優勢真菌在各樣品中并非均勻分布。王雪山等[23]通過高通量測序技術還發現，在清香型白酒發酵過程中，真菌種群中子囊菌門在所有酒醅中占主導地位；優勢真菌屬包括畢赤酵母屬、假絲酵母屬、曲霉屬、復膜孢酵母屬和Kazachstania；雷振河[24]應用高通量測序技術對清香型白酒釀造用大曲和酒醅中微生物構成進行了分析，發現大曲中優勢真核微生物主要包括曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬、嗜熱真菌屬、假絲酵母屬。上述結論中的真菌優勢屬間均有相似之處，但結論中卻沒有出現一個共有的優勢真菌屬。出現這一結果這可能是由于原料、地域、環境、發酵工藝等因素不同造成的。

圖3 基于真菌門（A）和屬（B）水平石花酒大曲樣品中細菌多樣性分析Fig.3 Analysis of fungal diversity in Shihua Baijiu Daqu samples based on the phylum (A) and genus (B) level

2.6 基于OTU水平的真菌多樣性分析

4個石花大曲樣品中的OTU數量及種類并非完全相同，其中平均相對含量＞1%的OTU有7個，其在各石花大曲樣品中的相對含量見圖4。

圖4 石花酒大曲樣品中平均相對含量＞1%真菌OTU統計分析Fig.4 Statistical analysis of OTU of fungi with mean relative abundance more than 1%in Shihua Baijiu Daqu samples

由圖4可知，平均相對含量＞1%的OTU（平均相對含量）分別為OTU2 668（43.97%）、OTU1 186（14.50%）、OTU65（5.04%）、OTU790（3.74%）、OTU1 246（1.42%）、OTU2 387（1.34%）和OTU3 135（1.00%），OTU均屬于子囊菌門，且這些OTU在各樣品中均存在。由圖4亦可知，各樣品中所有相對含量＞1%的OTU的平均累計相對含量已達71.03%。在每個樣品中均出現的真菌門為樣品的核心真菌門。由此可見，石花大曲樣品中的核心真菌門為子囊菌門，且各樣品相對含量存在差異。

2.7 石花大曲真菌與細菌優勢屬的相關性分析

采用SAS V8軟件對4個石花大曲樣品中的真菌和細菌的優勢屬進行初步的相關性分析，結果見圖5。

圖5 石花酒大曲優勢真菌屬與細菌屬相關性分析熱圖Fig.5 Heat map of relativity analysis of dominant fungi and bacteria genera in Shihua Baijiu Daqu

由圖5可知，假單胞菌屬和曲霉屬呈現顯著正相關（P＜0.05），R=0.96，而其他真菌與細菌優勢屬之間相關性均不顯著（P＞0.05），且部分呈現負相關。說明假單胞菌屬細菌和曲霉屬真菌在石花大曲中有著相互促進生長的作用，而其他屬的細菌與真菌相互促進作用不明顯，有的甚至相互抑制生長。

3 結論

本研究使用IlluminaMiSeq高通量測序技術，以16SrRNA的V3-V4區和18S rRNA的V4-V5區為測序靶點，對石花大曲中的細菌和真菌微生物多樣性進行分析。結果發現，石花大曲中的細菌主要由隸屬于變形桿菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）的假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和Kroppenstedtia的7個屬組成；石花大曲中的真菌主要由隸屬于子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和Mucoromycota的復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、紅曲菌屬（Monascus）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、青霉菌屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和Leiothecium6個屬組成，且石花酒曲樣品共有大量的核心細菌和真菌菌群。此外，本研究還發現細菌中的假單胞菌屬與真菌的曲霉屬有顯著的正相關性（P＜0.05）。該研究為石花大曲中微生物資源的開發奠定一定的理論基礎。