黃蜀葵和秋葵不同部位黃酮類成分含量測定方法研究

★ 李婧 劉玉翠 高宇丹 范如玉 肖井雷*（.長春中醫藥大學藥學院 長春 307；.長春中醫藥大學附屬醫院 長春 300）

黃蜀葵Abelmoschus manihot（L.） Medic.和秋葵Abelmoschus esculentu（L.）Moench均為錦葵科秋葵屬一年生或多年生草本植物，黃蜀葵花具有清利濕熱、消腫解毒的作用［1］。而黃蜀葵種子具有清熱解毒、涼血消腫的功效，可用于淋證、水腫、便秘、乳汁不通、癰腫、跌打損傷的治療，為“催生及利小便之要藥”［2］。國外研究種子油有多種醫療保健作用，但國內對其開發利用報道較少［3］。秋葵是一種保健蔬菜，其中含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、游離氨基酸、礦物質、維生素、生物堿等多種生物活性成分［4-5］。具有抗疲勞、健胃保肝、能減少肺損傷、提高機體免疫力、抗癌作用、利尿、增強血管擴張力、保護心臟等保健功能［6］。

據報道黃蜀葵和秋葵中主要含有黃酮類成分，且部分成分尚未建立適宜的質量評價方法。本實驗對黃蜀葵花、種子，秋葵花、種子、果實中金絲桃苷、楊梅素、槲皮素的含量測定方法進行了研究，為黃蜀葵、秋葵的質量控制標準研究提供了理論依據。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-2030高效液相色譜儀（島津企業管理中國有限公司）；FA1004B十萬分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；JA2603B萬分之一天平（上海天美天平儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 金絲桃苷對照品（購于中國食品藥品檢定研究院，CAS：48236-0）；槲皮素對照品（北京普天同創生物科技有限公司，CAS：117-39-5）；楊梅素（北京普天同創生物科技有限公司，CAS：529-44-2）。甲醇（分析純，北京化工廠）；乙腈（色譜純，Fisher公司）；磷酸（分析純，天津市福晨化工試劑廠）；水為純凈水。

1.3 藥材 樣品采自長春中醫藥大學七星百草園。經長春中醫藥大學肖井雷副教授鑒定：黃蜀葵花、種子為錦葵科黃蜀葵Abelmoschus manihot（L.）Medic.的干燥花和種子；秋葵花、種子、果實為錦葵科秋葵Abelmoschus esculentu（L.） Moench的干燥花、種子和果實。

2 方法與結果

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 流速 在色譜柱Inertsil? ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）、柱溫30℃條件下，考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）對黃酮類成分分離的影響。結果表明，流速為1.0 mL/min時，系統壓力適中，靈敏度高，分離度好。故該方法確定流速為1.0 mL/min。

2.1.2 流動相 在色譜柱Inertsil? ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）、柱溫30℃、流速為1.0 mL/min條件下，考察了不同梯度的乙腈-0.4%磷酸溶液（23∶77、25∶75、28∶72、30∶70）對黃酮類成分分離的影響。結果表明，黃蜀葵花采用乙腈-0.4%磷酸溶液（28∶72）洗脫，而黃蜀葵種子、秋葵采用乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脫（0～30 min 23∶77；30～35 min 27：73）

上述研究確定黃蜀葵花的色譜條件（Ⅰ）為：色譜柱Inertsil? ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.4%磷酸溶液（28∶72）；檢測波長360nm；流速1.0mL/min；柱溫30 ℃；進樣量4 μL。黃蜀葵種子、秋葵的色譜條件（Ⅱ）為：色譜柱Inertsil? ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.4%磷酸溶液；梯度洗脫（0～30 min 23∶77；30～35 min 27∶73）流速1.0 mL/min；檢測波長360 nm；柱溫30℃ ；進樣量 10 μL。

2.2 混合對照品的制備 精密稱定金絲桃苷、楊梅素、槲皮素對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含0.1 mg、0.05 mg、0.05 mg的混合溶液（Ⅰ），含0.07 mg、0.03 mg、0.002 5 mg的混合溶液（Ⅱ），即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取供試品各1.000 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min（250 W，30 KHz），放冷，稱重，用甲醇補足減失重量并搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取混合對照品溶液Ⅰ4，8，12，16，20 μL，按色譜條件Ⅰ進樣，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。金絲桃苷，楊梅素、槲皮素的回歸方程分別為Y=266 476X+86 820，Y=13 210X+1 146.9，Y=18 188X-1 296.1；相關系數r分別為0.999 8、0.999 9、0.999 9 ；線性范圍分別為 0.4～2.0 μg，0.2 ～1.0 μg，0.2～1.0 μg。

取混合對照品溶液Ⅱ2，4，6，8，10 μL，按色譜條件Ⅱ進樣，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程。金絲桃苷，楊梅素、槲皮素的回歸方程分別為Y=211 710X-371.4，Y=140 332X+4 841.3，Y=10 708X-1 173.4；相關系數r分別為0.999 7、0.999 6、0.999 5；線性范圍分別為 0.14～0.7 μg，0.06～0.3 μg，0.005～0.025 μg。

2.4.2 精密度實驗 精密吸取混合對照品Ⅰ4 μL，連續進樣6次，記錄峰面積。計算金絲桃苷、楊梅素、槲皮素RSD分別為1.05%，1.16%，1.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 精密吸取黃蜀葵花供試品4 μL，室溫下分別放置0，2，4，8，12，24 h后進樣測定，記錄峰面積。計算黃蜀葵花中金絲桃苷、楊梅素、槲皮素的RSD（n=6）分別為1.7%、1.5%、1.1%，表明該供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.5 重復性試驗 精密稱取1.000 g黃蜀葵花干燥粉末6份，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按色譜條件Ⅰ下方法測定峰面積，計算金絲桃苷、楊梅素、槲皮素的RSD（n=6）分別為1.6%、1.7%、1.9%，，結果表明該方法重復性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗 精密稱取黃蜀葵花供試品粉末6份，分別精密加入一定量3種對照品，按照2.3項下方法制備供試品溶液，按色譜條件Ⅰ下方法測定峰面積，計算各成分的加樣回收率及RSD。結果金絲桃苷、楊梅素和槲皮素的平均回收率分別為101.36%、97.89%和99.63%，RSD分別為1.39%、1.18%和1.54%，表明該方法加樣回收實驗結果良好。

2.5 樣品測定 分別精密吸取各供試品溶液Ⅰ（4 μL）、Ⅱ（10 μL），注入高效液相色譜儀，測定各成分含量。HPLC圖見圖1。

測定結果顯示，金絲桃苷含量：黃蜀葵花（12.7 mg/g）＞秋葵花（0.052 6 mg/g）＞黃蜀葵種子（0.005 2 mg/g）＞秋葵果實（0.004 1 mg/g）＞秋葵種子（0.002 5 mg/g）；楊梅素含量：僅存于黃蜀葵花中（0.41 mg/g）；槲皮素含量：黃蜀葵花（0.197 mg/g）＞秋葵花（0.015 mg/g）＞黃蜀葵種子（0.007 2mg/g）＞秋葵種子（0.005 1 mg/g）。本研究表明三種黃酮類成分在黃蜀葵和秋葵不同部位的含量存在明顯差異，以花中三種成分含量最多，其次是種子，最后為果實。本次研究為黃蜀葵和秋葵高效資源化分析利用提供了依據。

圖1 各樣品溶液HPLC圖

3 小結與討論

（1）本方法首先參照2015版《中國藥典》中測定金絲桃苷含量的色譜條件進行三種成分的洗脫，即乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），結果顯示金絲桃苷的峰且出峰時間在42min左右，楊梅素出峰時間在60 min左右，出峰時間過長［7-8］。進而更改流動相比例為乙腈-0.1%磷酸溶液20∶80，出峰時間雖縮短但拖尾嚴重；為消除拖尾現象又將0.1%的磷酸溶液改成0.4%磷酸溶液，并依次用不同比例的乙腈-0.4%磷酸溶液摸索出最佳色譜條件。

（2）采用HPLC法單獨測定金絲桃苷、槲皮素、楊梅素含量的報道較多［9-11］，但同時測定黃蜀葵和秋葵中三種成分含量的方法卻未見報道，本文通過優化色譜條件，建立了同時測定金絲桃苷、槲皮素、楊梅素含量的方法，且該法結果準確，靈敏度高，重現性好，能夠對黃蜀葵和秋葵不同部位中金絲桃苷、楊梅素、槲皮素的含量進行定量分析，為其質量評價提供了依據。