基于COI基因的橡膠樹六點始葉螨遺傳多樣性分析

聶躍 盧塘飛 陳俊諭 張方平 牛黎明 符悅冠

摘 ?要：六點始葉螨是橡膠樹上的重要害螨之一，具有分布范圍廣、危害重等特點。為了研究其遺傳多樣性和遺傳分化，本研究利用線粒體COI（mitochondrial cytochrome oxidase subunit I）基因序列對采自海南、云南、越南河內(nèi)等地區(qū)橡膠樹上的11個不同地理種群的165頭樣本進行了種群的遺傳多樣性分析。獲得的六點始葉螨線粒體COI基因片段長度均為658 bp，分析發(fā)現(xiàn)可變位點30個，其中簡約信息點15個，單變異位點15個，單倍型15種;種群間FST值為0.34698，Nm值為0.47，GST值為0.19660，表明11個種群的六點始葉螨存在一定的遺傳分化。

關(guān)鍵詞：六點始葉螨;COI;地理種群;遺傳分化

中圖分類號：S435.76 ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

Abstract： Eotetranychus sexmaculatus （Riley） is one of the most important pests of rubber trees， with a wide geographical distribution and heavy infestation. In order to study its genetic diversity and genetic differentiation， the mitochondrial COI gene sequence was used to analyze the genetic structure of 165 individuals from 11 different geographical populations collected from rubber trees in Hainan， Yunnan and Hanoi （Vietnam）. The obtained mitochondrial COI gene fragment of the six-pointed spider mites was 658 bp in length. There were 30 variable sites， including 15 simple information points， 15 single mutation sites， and 15 haplotypes. The FST value between populations was 0.34698， the Nm value was 0.47， and the GST value was 0.19660， indicating that there was genetic differentiation in the 11 populations of E. sexmaculatus （Riley）.

Keywords： Eotetranychus sexmaculatus （Riley）; COI; geographic population; genetic differentiation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.019

六點始葉螨[（Eotetranychus sexmaculatus （Riley））屬于葉螨科（Tetranychidae）、始葉螨屬（Eotetranychus）。自20世紀(jì)70年代首次爆發(fā)危害橡膠樹以來，該螨已成為我國橡膠樹的重要害蟲，危害造成葉片變黃、落葉、導(dǎo)致停割降低乳膠產(chǎn)量乃至枝條甚至橡膠樹死亡[1-3]。六點始葉螨的寄主范圍較廣，包括橡膠、柑橘、腰果、番石榴、芒果、菠蘿蜜、油桐、茶樹、油梨、苦楝、臺灣相思等20多種經(jīng)濟植物[4-6]。六點始葉螨在國內(nèi)發(fā)生范圍較為廣泛，海南、云南、廣東、廣西、福建、四川及臺灣等省份均有發(fā)生[7]，但在不同區(qū)域其發(fā)生程度存在差異，目前國內(nèi)外有關(guān)該螨不同地理種群是否產(chǎn)生遺傳分化未見報道。

近些年來，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA條形碼被廣泛用于研究昆蟲的遺傳分化，其中mt-DNA 是用于研究分子分類和系統(tǒng)發(fā)育的常見基因，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于物種起源和分化以及物種的鑒定和分類等方面的研究[8]。作為分子標(biāo)記用于研究系統(tǒng)發(fā)育手段之一，mt-DNA具有很多優(yōu)點。線粒體DNA是典型的母系遺傳，在細胞分裂時不會發(fā)生基因重排，避免了由于遺傳方式帶來隨機性[9-10]。目前關(guān)于重要害螨地理種群研究報道十分的豐富。楊順義等[11]利用線粒體COI基因分析甘肅二斑葉螨Tetranychus urticae地理種群，表明二斑葉螨遺傳分化主要來自種群內(nèi)部，種群間還未發(fā)現(xiàn)明顯的遺傳分化。楊小強[12]利用線粒體COI基因分析馬六甲肉食螨地理種群，得到遺傳分化主要來自種群間，種群內(nèi)遺傳分化較小。

鑒于六點始葉螨危害的嚴(yán)重性及針對其在不同區(qū)域和年份發(fā)生程度存在差異等情況，本研究采用線粒體DNA COI基因作為分子標(biāo)記，從分子遺傳學(xué)的角度分析橡膠種植區(qū)六點始葉螨不同地理種群的種群遺傳分化及種內(nèi)遺傳，以明確六點始葉螨是否產(chǎn)生遺傳分化，分析不同區(qū)域發(fā)生原因。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試蟲源：六點始葉螨在2018年9月—2019年6月采自中國海南、云南、廣東和越南河內(nèi)等地區(qū)（表1），合計11個地理種群共165頭樣本。樣本采集時，用滅菌的1.5 mL離心管裝有95%的酒精臨時保存，備用。

試劑和儀器：TAE緩沖液、NP-40、Tween-20、Goldview I型核酸染料，北京索萊寶科技有限公司;20 mg/mL蛋白酶K及PCR相關(guān)試劑，寶生物工程（大連）有限公司;DNA Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司。聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)、C1000Touch Thermal Cycler PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總DNA提取 ?從95%的酒精中將螨蟲取出，然后用滅菌去離子的水浸泡2～3 h;配置100 μL緩沖液（86.1 μLddH2O、10 μL10xPCR buffer （Mg?+）、3 μL 20 mg/ml蛋白酶K、0.45 μL NP-40、0.45 μL Tween-20）;將清洗完畢的樣品，放到緩沖液中（每個離心管放單頭雌成蟲），立即用塑料研磨棒研磨，研磨后放置在55 ℃的水浴鍋中孵育90 min，95 ℃初始變性10 min，得到的總DNA溶液即可進行PCR反應(yīng)或者放?20 ℃冰箱保存。

1.2.2 ?引物和PCR擴增 ?本研究線粒體COI使用通用引物L(fēng)EPF1/LEPR1是參考Folmer等[13]引物并修改而來，上游引物為LEPF1：5'-ATTC-AACCAATCATAAAGATATTGG-3'，下游引物為LEPR1：5'-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAA?TC-3'。引物均由武漢金斯瑞生物科技有限公司合成。線粒體COI基因50 μLPCR反應(yīng)體系：DNA模板5 μL、2×Gflex Buffer 25 μL、Tks Gflex DNA ?Polymerase 1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、17 μLddH2O。PCR反應(yīng)過程：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，44 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，35個循環(huán)：最后修復(fù)延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物送至廣州賽默飛世爾科技有限公司測序。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

以11個地理種群165頭六點始葉螨的DNA模板進行線粒體基因COI的PCR擴增所得到的DNA序列，Chromas讀取序列圖，DNAstar去除引物剪切比對序列，并人工核對校正。具有核苷酸多態(tài)性的堿基序列，重復(fù)測序2次以保證準(zhǔn)確性。

運用MEGA7.0軟件[14]分析DNA序列的堿基組成，堿基突變位點。采用Kimura-2-parameter模型，用最大似然法（maximum likelihood， ML）構(gòu)建系統(tǒng)樹，采用Bootstrap 1000次檢驗分子系統(tǒng)樹各分支的置信度;應(yīng)用 Arlequin 3.5軟件[15] 計算群體間的分化系數(shù)FST（不同種群間的基因分化程度）和基因差異分化系數(shù)GST（相對于整個種群的基因分化）;采用DnaSP 5.0[16]統(tǒng)計單倍型數(shù)目及出現(xiàn)頻率并進行基因流Nm（每代遷入有效個體數(shù)）的計算。使用Network 5.0[17]軟件繪制基于median-joining的單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?線粒體COI基因分析

用引物L(fēng)EPF1和LEPR1對線粒體DNA COI基因進行擴增，電泳結(jié)果見圖1。去除引物后序列長度為658 bp，其中ATGC的比例：A%=47.3%;C%=9.8%;G%=12.0%;T%=30.9%。在堿基含量中，可以明顯看出A+T的含量明顯高于G+C的含量。通過搜索NCBI數(shù)據(jù)庫沒有發(fā)現(xiàn)高相似度的目的基因，提交DNA序列到NCBI數(shù)據(jù)庫獲得登錄號為MN338390。

通過軟件分析得到，序列中不變位點628個，可變位點（variable sites）30個，占總分析位點4.56%;其中單變異位點（2個變體）[singleton variable sites （two variants）]15個，占總位點數(shù)的2.28%，位點分別是25、43、147、359、364、367、419、422、491、525、535、541、571、607、646;簡約信息位點（2個變種）[parsimony informative sites （two variants）]14個，位點數(shù)為33、38、73、111、116、123、264、299、339、360、522、526、566、613，占總位點數(shù)的2.13%;簡約信息位點（3個變種）[parsimony informative sites （there variants）]1個，占總位點數(shù)的0.15%，位點數(shù)是101，具體可變位點分布如圖2，可變位點集中在500～600 bp之間。DNA無堿基缺失和替換。

2.2 ?單倍型、核酸多樣性及中性檢驗

11個不同地區(qū)六點始葉螨參數(shù)見表2。單倍型多樣性（Hd）0.423，方差單倍型多樣性0.00501，標(biāo)準(zhǔn)差單倍型多樣性0.071。核苷酸多樣性（Pi）0.00248，核苷酸平均差異數(shù)（K）1.629。說明六點始葉螨整體的遺傳多樣性水平不高。165頭六點始葉螨線粒體COI基因序列共鑒定出15種單倍型（Ha）。其中Hap_1是共享單倍型，每個地理種群都有該單倍型;其中云南江城單倍型最多，有5種分別是Hap_1、Hap_6、Hap_7、Hap_8、Hap_9;儋州、河口、化州、越南河內(nèi)僅有一種單倍型。

中性檢測Tajimas D：?2.32446，當(dāng)Tajimas D統(tǒng)計值為正值時說明種群進化方式為平衡選擇，且有一些單倍型分化;統(tǒng)計值負(fù)值時為負(fù)向選擇，無顯著性差異。中性檢驗表明，11個地理種群六點始葉螨進化方式為負(fù)向選擇，無顯著性差異。

2.3 ?系統(tǒng)進化和遺傳分析

種群間的分化程度主要通過分化系數(shù)FST和GST，每代遷入有效個體數(shù)基因流Nm衡量。本研究六點始葉螨種群間FST值為0.34698，表明分化程度為顯著水平。Nm值為0.47，GST值為0.19660，表明六點始葉螨11個地理種群存在一定的基因交流的同時又存在遺傳分化。

以加州鈍綏螨（GenBank登錄號：AB500?131.1）和神澤氏葉螨（GenBank登錄號：AY044644.1）的線粒體COI基因構(gòu)建六點始葉螨單倍型N-J系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹上各分枝的數(shù)值經(jīng)為過1000次bootstrap的置信度，鄰近法建樹圖見圖3。構(gòu)建基于mtDNA COI基因的六點始葉螨不同地理種群單倍型中介網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4。由圖3和圖4可得，六點始葉螨單倍型沒有明顯的分化，只有單倍型Hap-4、Hap-8和Hap-7、Hap-9、Hap-13、Hap-14形成了2個聚類簇，另外單倍型Hap-1為共享單倍型，出現(xiàn)頻率最高。

2.4 ?不同地區(qū)地理種群間差異性比較

不同地區(qū)間地理種群見表3。各地區(qū)間的遺傳分化指數(shù)FST值在?0.01974～0.75000之間，其中云南瑞麗和海南瓊中與其他的地理種群差異性最大，河口和其他地理種群差異性比較小。GST值在?0.03317～1.00000之間。

3 ?討論

線粒體DNA是真核細胞中具有母系遺傳，比較保守的基因流，是一種研究種和亞種的系統(tǒng)發(fā)育以及種群之間關(guān)系的分子工具[18]。本研究以線粒體COI基因為工具，研究了海南、云南和越南河內(nèi)等地區(qū)橡膠上11個不同地理種群間六點始葉螨的遺傳關(guān)系發(fā)現(xiàn)：六點始葉螨種群間FST值為0.34698，表明分化程度為顯著水平，Nm值為0.47，GST值為0.19660，15種單倍型，表明六點始葉螨11個地理種群存在一定的基因交流的同時又存在遺傳分化。

通過分析六點始葉螨不同的地理種群可得：15種單倍型中，海南省只有4種單倍型，云南省有12種單倍型，廣東和越南都只有1種共享單倍型，說明云南省單倍型種類十分豐富。另外各個地區(qū)之間的遺傳分化指數(shù)FST值在?0.01974～ 0.75000之間，其中云南瑞麗分化程度很高，可能是這個地區(qū)的區(qū)域性氣候有關(guān)，而且瑞麗處于中緬邊境，六點始葉螨與境外的種群交流緊密，形成了一定的分化。另外云南省整體遺傳分化指數(shù)明顯高于海南和廣東省，原因可能有以下幾點：（1）吳蕾等[19]研究認(rèn)為，葉螨的發(fā)育速率受制于溫度，發(fā)育速率又極大地影響其地理種群的增大，反之超過最適溫度，發(fā)育歷程受到影響，種群數(shù)量下降。通過分析發(fā)現(xiàn)海南、越南和廣東經(jīng)度不高，基本在20°N左右，在熱帶地區(qū)，云南采樣點都在北緯20°N以上，處于不同熱帶和亞熱帶邊緣，而且橡膠的種植跟經(jīng)緯度有著密切的聯(lián)系。

比如：熱帶和亞熱帶不同的溫度對螨蟲發(fā)育速率產(chǎn)生影響;可能因為溫度原因改變橡膠內(nèi)部生理生化物質(zhì)，從而引起螨蟲遺傳分化。（2）海南、廣東、越南都靠近海邊，雨水充足，云南在內(nèi)陸，降雨量有限，然而螨蟲對于雨水比較敏感，如果降水量較少，會直接導(dǎo)致螨類數(shù)量急劇上升。另外降水量減少，會對螨蟲發(fā)育產(chǎn)生影響，并遺傳給下一代，從而產(chǎn)生遺傳分化。（3）都二霞等[20]和徐建祥等[21]發(fā)現(xiàn)，紫外線脅迫可以改變螨蟲的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA結(jié)構(gòu)，也可以改變寄主植物結(jié)構(gòu)。本研究中云南處于熱帶和亞熱帶邊緣，光照和紫外線強度都沒有海南、越南等地區(qū)強烈，這些差異可以改變?nèi)~螨的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，或者影響橡膠樹光合反應(yīng)，改變橡膠樹物質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而間接影響六點始葉螨系統(tǒng)發(fā)育。（4）云南和其他地區(qū)種植的橡膠樹品種存在差別，其品種通常抗寒性更強，由于寄主品種的差異從而影響了六點始葉螨的發(fā)育。綜上所述，六點始葉螨遺傳分化不僅跟地理距離有關(guān)系，跟溫度、濕度、光照等外部環(huán)境有著密切的聯(lián)系。比如：2019年4—6月云南發(fā)生旱災(zāi)，導(dǎo)致云南主要的橡膠種植區(qū)螨蟲大爆發(fā)。由此可見，溫度和濕度對于螨蟲的數(shù)量和發(fā)育有著密切的聯(lián)系。

蜱螨個體較小，相似種外表和體色差異無法從形態(tài)上分辨，因此研究者引用線粒體COI基因，作為蜱螨分類的重要輔助手段。例如：鄧潔等[22]利用線粒體COI基因鑒定印度新曲厲螨。通過比較六點始葉螨的線粒體COI基因和NCBI數(shù)據(jù)庫其他螨蟲的基因發(fā)現(xiàn)：六點始葉螨最高相似度是葉螨科COI基因只有92.69%（提交數(shù)據(jù)庫后登錄號MN338390），與其他的葉螨科螨類差異性較大，可以作為種間鑒定分析的DNA條形碼，用于快速鑒定。另外，本研究還存在很多的不足，比如采集樣本點較少，并且各采樣點之間的分布不均勻，同時本研究僅選用了線粒體COI基因，并不能完全反映出六點始葉螨的遺傳分化多樣性，還需將本研究結(jié)合DNA序列分析方法與SSR、ISSR標(biāo)記法相互結(jié)合進行更加深入的探討。

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