不同甘蔗品種根際土壤酶活性及微生物群落多樣性分析

農澤梅 史國英 曾泉 葉雪蓮 秦華東 胡春錦

摘 ?要：通過桶栽試驗，比較了8個甘蔗品種吸氮效率的差異以及不同品種根際土壤酶活性和微生物群落多樣性的差異，以期為甘蔗生產上的選種以及蔗地土壤生產力的維持提供科學支持。在甘蔗大生長期末期收集甘蔗植株和根際土壤，比較不同品種甘蔗植株的吸氮效率和氮肥利用率、測定根際土壤蔗糖酶以及脲酶活性、利用Miseq高通量測序技術對甘蔗根際細菌群落多樣性進行分析。研究結果表明，不同甘蔗品種在大生長期末期的吸氮效率存在一定差異，8個品種的植株平均吸氮效率為17.95%～27.57%，氮肥利用率為22.15%～34.02%，其中吸氮效率及氮肥利用率最高的品種是‘桂糖44號，最低的是‘桂選B9;8個品種的根際土壤蔗糖酶活性3.51～6.56 mg/（g·d），脲酶活性1.12～ 1.42 mg/（g·d），不同品種間存在一定差異，土壤酶活性表現較高的品種為‘桂糖48號和‘新臺糖22號，而‘粵糖93159的土壤酶活相對較低。高通量測序分析結果顯示，8個不同品種甘蔗根際土壤細菌種群結構存在一定差異，不同品種間在優勢菌群組成上差異不顯著，主要差異表現在優勢菌屬的豐度上，其中‘桂糖44號和‘粵糖93159均以Bacillus為最主要的優勢菌屬，而其他6個品種的主要優勢菌屬均為Chryseolinea。冗余分析結果顯示，甘蔗氮吸收率、土壤堿解氮含量以及土壤pH對土壤微生物群落結構的影響最大;相關性分析表明，不同甘蔗品種吸氮效率的差異以及部分土壤理化指標均與根際土壤微生物群落中不同優勢菌門存在一定的相關性;根系微生物菌群結構的差異可能在一定程度上影響了甘蔗的吸氮效率。本研究結果初步揭示了不同甘蔗品種氮肥利用率與根際微生物群落結構的相關關系，為深入研究甘蔗根際微生物多樣性及功能與環境因子之間的關系提供了借鑒。

關鍵詞：甘蔗;根際土壤;土壤酶活;微生物群落多樣性

中圖分類號：S154 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： In order to provide scientific support for the selection of sugarcane production and the maintenance of sugarcane soil productivity， the differences in nitrogen uptake efficiency of eight sugarcane varieties and the effects of different varieties on the enzyme activities and microbial community diversity in the rhizosphere soil were compared through the barrel cultivation experiment. Sugarcane plants and rhizosphere soils were collected at the end of large growth stage of sugarcane， and nitrogen utilization efficiency， invertase and urease activities in the rhizosphere soil of different sugarcane varieties were measured and compared. Meanwhile， the bacterial community structure of the sugarcane rhizosphere soil was determined and analyzed by the Miseq high-throughput sequencing technology. The nitrogen uptake efficiency of different sugarcane varieties was different. The average nitrogen uptake efficiency of the eight varieties was 17.95%27.57%， and the nitrogen use efficiency was 22.15%34.02%. The highest nitrogen uptake efficiency was for GT44， and the lowest was for B9. The invertase activity of the rhizosphere soil was 3.516.56 mg/（g·d）， and there were significant differences among different cultivars. But the urease activity was 1.121.42 mg/（g·d）， and there was few differences among different varieties. GT48 and ROC22 were the two varieties with higher soil enzyme activity in the rhizosphere. The results of high-throughput sequencing showed that there were some differences in the bacterial population structure in the rhizosphere soil of the eight sugarcane varieties， but there was no significant difference among different varieties in the composition of the dominant bacteria， and the main difference was in the abundance of the dominant genera. Bacillus was the dominant genus for GT44 and Y93159， while Chryseolinea was the dominant genus for the other six varieties. Redundancy analysis （RDA） showed that the nitrogen absorption efficiency of sugarcane， the content of available N and pH value of soil had the greatest effect on the soil microbial community structure. Correlation analysis showed that the nitrogen absorption efficiency of sugarcane and soil physiochemical characteristics were significantly correlated with different dominant microbial communities. This study would deepen the understanding of the microbial community in the sugarcane rhizosphere and provide references for the relation between the microbial composition and diversity with environmental factors.

Keywords： sugarcane; rhizosphere soil; soil enzyme activity; microbial community diversity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.025

根際是植物根系與土壤交界的微域，是植物-土壤-微生物及其環境相互作用的一個特殊界面[1]。土壤酶與土壤微生物以及作物3者之間的關系是當前土壤微生態研究的熱點問題[2-3]。分析和比較不同作物的根際微生態特性，包括土壤酶活性以及微生物菌群結構，可為從微生態學角度挖掘作物的低肥高效栽培潛力提供理論依據。

甘蔗（Saccharum officinarum）是世界上最重要的糖料和能源作物。我國是產蔗大國，其中廣西是中國最大的蔗糖生產區，甘蔗和蔗糖產量占全國的60% 以上[4]。然而，由于我國甘蔗主產區的主要耕作土壤類型為紅壤土或赤紅壤土，具有pH低、養分含量低、硝化與反硝化活性低等特點，甘蔗生產上一直面臨著產量過于依賴化學肥料投入的困境，產業缺乏國際競爭力;同時，大部分老蔗區還面臨著甘蔗品種退化、土地肥力下降的現狀。近年來，相關科研工作者已就甘蔗生產上的“肥藥雙減”問題，從不同角度開展了大量研究[5]。李文寶[6]和楊榮仲等[7]對不同氮水平條件下不同甘蔗品種材料的產量、耐低氮脅迫能力等進行了比較，發現不同品種間存在顯著差異。但是，由于甘蔗遺傳背景比較復雜，目前關于甘蔗氮素高效利用機制的研究進展比較緩慢。近年來，植物根際微生物區系與土壤可持續生產力的關系等相關研究受到越來越多的關注[8-9];對作物根際微域的研究，可以挖掘具有潛力的微生物資源、探究植物病害發生的機制[10]。不同作物、或者同一作物不同品種間的差異也可通過根際土壤酶活性和土壤微生物多樣性的差異表現出來，如具有不同抗逆性或抗病性存在差異的品種間的根際土壤微生物群落結構也存在明顯的差異[11-16]。目前關于甘蔗根際土壤微生態區系的研究，多集中在不同栽培模式下對甘蔗的影響。前人研究表明，間、套種等種植模式可改善宿根蔗的土壤生態環境，而單一的宿根甘蔗連作容易導致其根際土壤總微生物量及酶活性下降，從而導致甘蔗產量下降，而宿根蔗套種大豆對其根際土壤微生物區系具有明顯的改善作用，從而使宿根蔗具有明顯的產量優勢[17-20]。然而，關于不同甘蔗品種間根系微生態區系的差異，特別是氮效率不同的甘蔗品種間的根際微生物群落結構及土壤酶活性的差異等，目前尚無系統的研究報道。本研究擬通過分析和比較不同甘蔗品種吸氮效率的差異及其對根際土壤酶活性和微生物群落多樣性的影響，以期為甘蔗生產上的選種以及蔗地土壤生產力的維持提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與試驗設計

試驗于2018年在廣西壯族自治區農業科學院試驗地進行，供試土壤為廣西甘蔗產區的典型紅壤土，為減少土壤的粘性，方便取甘蔗的根際土壤進行分析，向紅壤土中混合了一定比例的菌糠作為甘蔗栽培土。將混合后的土壤分裝于甘蔗栽培桶內，每桶15 kg。混合栽培土的pH 6.89，速效氮含量為228.2 mg/kg。

供試甘蔗品種為：‘新臺糖22號（ROC22）、‘粵糖93159（Y93159）、‘桂選B8（B8）、‘桂選B9（B9）、‘桂糖42號（GT42）、‘桂糖44號（GT44）、‘桂糖46號（GT46）、‘桂糖48號（GT48）。甘蔗采用種莖單芽育苗，選取生長基本一致的甘蔗幼苗進行移栽，每桶種3個單株，每品種種植4桶，甘蔗桶栽后擺放于試驗地中，自然條件下生長。

甘蔗于2018年4月初移栽，6月初施肥1次，參照大田管理施肥用量，每桶施復合肥54 g，尿素14 g，氯化鉀15 g，進行穴施，同時每桶培土5 kg;于9月上旬在甘蔗伸長期末期對甘蔗植株進行整株采收同時采集根際土壤用于實驗分析。因此，甘蔗每桶栽培土壤的重量固定為20 kg，栽培土速效氮含量為228.220=4546 mg，約4.55 g;根據相關比例測算結果每桶施肥含氮量為19.46 g。

1.2 ?方法

1.2.1 ?甘蔗植株及根際土樣的收集與處理 ?去除每桶甘蔗表層5 cm的浮土，然后將整桶土壤拍散并取出完整的甘蔗植株，將根系上的土壤抖落回栽培桶的中，植株解析成根、莖、葉，分別清洗干凈并晾干后進行稱量、用切割機切碎并混合均勻，根據測定指標需要取一定量烘干后粉碎，用于甘蔗植株氮素含量的測定。根據下式計算各處理甘蔗的氮素吸收效率以及氮素的相對利用率：

植株氮素累積量=植株干物重氮素含量

氮素吸收效率=[植株氮素累積總量/土壤的速效N（肥料N+土壤N）]100%

氮肥利用率=（植株N累積總量/肥料N）100%

由于取樣時甘蔗的根系已經遍布整個栽培桶，故此除去表層土的整個栽培桶的土壤均作為根際土壤，每桶土樣混合均勻后，過1 mm篩，按擬分析指標的需要分裝到無菌封口袋中保存備用。土樣分別用于根際細菌種群多樣性分析、土壤pH、土壤總N、速效N含量和土壤酶活性測定等。

1.2.2 ?土壤pH和氮素含量測定 ?土壤風干后用于pH和土壤氮素含量測定，參考《土壤農業化學分析方法》[21]，其中土壤總氮含量測定采用凱氏定氮法，土壤速效氮含量測定采用堿解擴散法，土壤pH測定采用電位測定法，水壤質量比2.5∶1。

1.2.3 ?土壤脲酶及蔗糖酶活性測定 ?土壤樣本風干后用于土壤酶活性的測定，其中土壤脲酶活性采用苯酚鈉比色法[22]測定，土壤蔗糖酶活性用3，5-二硝基水楊酸比色法[23]測定。

1.2.4 ?根際細菌群落多樣性測定 ?收集后的新鮮根際土壤保存于?80℃冰箱，提取土壤微生物DNA，經檢測合格后用于構建文庫，以各土壤樣品微生物總DNA為模板，以細菌V3+V4區特異引物（338F/806R）進行PCR擴增，采用Illumina MiSeq測序平臺對PCR產物進行雙端測序分析，委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成測序。細菌種群多樣性則通過在美吉生物i-sanger云平臺上提供的測序結果進行個性化分析。

Bacillus、Chryseolinea、Paenibacillus、Lysin?iba?c?i??llus、Truepera、Variibacter、Mesorhizobium和Brevi?bacillus等。根據以上菌屬在不同樣品中的OTU數量建立柱狀圖（圖4），結果顯示，GT44和Y93159均以Bacillus為最主要的優勢菌屬，而3類芽孢菌Paenibacillus、Lysinibacillus、Breviba?cillus也是這2個品種根際細菌中的最主要菌屬之一;而其他6個品種的最優勢菌屬均為Chryseolinea。

2.5 ?甘蔗根際土壤細菌群落的主要影響因子分析

為明確甘蔗的氮吸收率和土壤理化性質（土壤氮素和堿解氮含量、土壤pH以及土壤脲酶和蔗糖酶活性對土壤細菌群落的影響，在細菌門分類水平上對土壤微生物群落進行冗余分析（RDA），結果見圖5。RDA分析的前2個軸總共解釋了87.79% 的群落變化，第1個軸解釋了71.81%，第2個軸解釋了15.98%。甘蔗氮吸收率對土壤微生物群落的影響最顯著，其次是土壤堿解氮含量;6個不同影響因子總共解釋了92.41% 的群落變化，影響的順序為甘蔗氮吸收率>土壤堿解氮含量>土壤pH值>土壤脲酶活性>土壤氮素含量>土壤蔗糖酶活性。

進一步分析了6個不同環境因子與土壤微生物群落的關系，對土壤細菌群落中的優勢菌群（門水平）和環境因子進行相關分析，相關性Heatmap見圖6。結果表明，僅甘蔗氮吸收率、土壤堿解氮含量和pH與部分優勢菌群[綠彎菌門（Chlo?ro?f?l?e?xi）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）酸桿菌門（Acidobacteria）]存在顯著或極顯著相關性，其他4個優勢菌群（Proteobacteria、Bacteroi??detes、Gemma?timon?a?detes和Deinococcus-Thermus）與相關環境影響因子的相關性均未達顯著水平。

3 ?討論

3.1 ?不同甘蔗品種的氮效率以及根際土壤部分理化性質的差異

本研究分析了8個甘蔗品種在大生長期末期的氮肥利用率以及根際土壤部分理化性質的差異，結果表明，不同甘蔗品種的氮肥利用率存在一定差異，其中有2個甘蔗品種GT42和GT44的氮肥利用率大于30%，氮肥利用率最低的是B9，為22.15%;所有甘蔗品種根際土壤的pH均較種植前提高，品種間存在一定的差異;甘蔗采收以后不同處理間的土壤氮素、堿解氮含量以及土壤酶活性亦表現出一定的差異。分析結果顯示，甘蔗的氮肥利用率與反映土壤理化性質的多個土壤環境因子之間未表現出顯著的相關性，卻一定程度上證明了不同甘蔗品種對根際土壤微生態的影響是有差異的。由于甘蔗的生長周期較長，本研究僅分析了甘蔗伸長期末期這一個時間點的相關信息。由于不同品種的生長特性可能存在一定差異，因此，本研究結果未能全面反映品種間真實的差異。但是，由于伸長期畢竟是甘蔗生長一個最重要的時期，也是氮肥需求量最高的一個時期。因此，本研究結果是具有一定的代表性和參考意義的。

3.2 ?甘蔗根際土壤微生物群落結構的特征

基于高通量測序的分析結果表明，不同甘蔗品種根系微生物的豐富度指數和多樣性指數均存在一定的差異，但不同處理間主要菌群種類基本相似，其主要差異表現在菌群的豐度上。在門分類水平以及菌屬水平上，不同處理間優勢菌屬的OUT數量都存在顯著差異。如不同甘蔗品種的根系微生物中都含以下8種已明確分類的菌屬：Bacillus、Chryseolinea、Paenibacillus、Lysini?ba?ci?llus、Truepera、Variibacter、Mesorhizobium和Bre?vi?bacillus，但以上優勢菌屬在不同甘蔗根系土壤樣本中的OTU數量差別較大。甘蔗品種GT44和Y93159均以Bacillus為最主要的優勢菌屬，另外3種芽孢桿菌Paenibacillus、Lysinibacillus以及Brevibacillus也是這2個品種根際細菌中的最主要菌屬之一，而其他6個品種的最優勢菌屬均為Chryseolinea。上述多種芽孢桿菌屬細菌的相關種群已被研究證明為許多動植物的益生菌，并已在生產上大量應用[24-26];而Chryseolinea菌屬為一類近年發現的菌群，據目前相關研究報道該菌屬細菌可能主要與生物降解相關[27-28]。因為不同菌群生物學和生態學功能上的差異，甘蔗根系微生物優勢菌群豐度的差異可能會最終影響根系土壤微域的生態學功能，從而影響不同品種的吸氮特性并導致品種間氮肥利用率的差異。

3.3 ?甘蔗根際土壤微生物群落結構與環境因子的關系。

甘蔗根際土壤微生物群落與甘蔗氮素吸收率和部分土壤理化因子的冗余分析表明，不同品種甘蔗的氮吸收率對微生物群落的影響最顯著，其次是土壤堿解氮含量和pH，其他理化因子如土壤酶活性等對土壤微生物群落結構均有重要的影響，說明土壤微生物群落結構與土壤環境關系密切。前人研究表明，植物種類對土壤微生物群落結構有重要影響，相關研究表明，植株根系分泌物對根際微生物群落結構組成具有選擇塑造作用，不同植物的根際微生物群落結構具有獨特性和代表性[7-9]。由于本研究中所有供試甘蔗品種在栽培管理上保持一致，盡可能地減少了處理間土壤環境因子的差異。因此，引起甘蔗品種根際微生物區系差異的主要因子是由品種間的差異，而品種間的差異也導致了根際土壤理化性質的差異。

4 ?結論

8個不同甘蔗品種大生長期的吸氮效率及其氮肥利用率存在一定差異，品種間的差異也表現在根系土壤酶活以及根系微生物區系上，不同品種間根系微生物主要菌群豐度存在顯著差異。甘蔗氮效率與根際微生物群落結構存在一定的相關性;同時，由于不同菌群生物學和生態學功能上的差異，根系微生物優勢菌群豐度的差異可能在一定程度上影響了甘蔗的吸氮效率。從本研究結果來看，甘蔗品種GT44的根系微生物菌群組成或許更適合植株的生長和土壤肥力的維持，其氮肥利用率也是8個供試甘蔗品種中最高的，為34.02%。在今后研究工作中，將持續跟蹤不同甘蔗品種在各生育時期的生長特性及其根系微域的變化，同時對甘蔗根際微生物研究將重點放在分析參與氮循環相關微生物菌群的豐度上，并將進一步分析甘蔗品種的宿根性表現，擬為建立一套從根際微域環境的差異篩選適合蔗地土壤生產力維護的氮高效甘蔗品種的技術方法提供理論依據。

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