山芝麻中β-谷甾醇的定性和定量分析

陳貴 夏稷子 徐作剛

【摘 要】? ?目的： 建立山芝麻中β-谷甾醇的定性和定量分析方法。 方法： TLC法對(duì)山芝麻中的β-谷甾醇進(jìn)行定性鑒別，HPLC法測(cè)定β-谷甾醇的含量。 結(jié)果 ：TLC斑點(diǎn)清晰，重復(fù)性好。β-谷甾醇在3.694～184.7 μg/mL（r=0.9999）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;平均加樣回收率為96.0%（RSD=1.17%）。 結(jié)論 ：該方法可應(yīng)用于山芝麻的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】? 山芝麻;β-谷甾醇;TLC;HPLC

【中圖分類號(hào)】R284.1? ?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A? ? 【文章編號(hào)】1007-8517（2020）11-0040-03

Qualitative and Quantitative Analysis of β-sitosterol in Radix Helicteris

CHEN Gui XIA Jizi XU Zuogang

Qiannan Institute for Inspection and Testing， Duyun 558000， China

Abstract：? Objective? To establish a method for qualitative and quantitative analysis of β-sitosterol in Radix helicteris.? Methods? The qualitative analysis of β-sitosterol was carried out by thin layer chromatography （TLC）. The content determination of β-sitosterol was using high performance liquid chromatography （HPLC）.? Results? The TLC spots were clear and reproducible. β-sitosterol showed a good linear relationship within the range of 3.694～184.7 μg/mL （r=0.9999）， whose average recovery was 96.0% with the RSD of 1.17%.? Conclusion? The method can be used for the quality control of Radix helicteris.

Key words： Radix helicteris; β-sitosterol; TLC; HPLC

山芝麻為梧桐科植物山芝麻Helicteres angustifolia L.的干燥根，具有解表清熱、解毒消腫的功效，用于感冒高熱、扁桃體炎、咽喉炎、腮腺炎、皮膚濕疹、癰腫等[1-2]。現(xiàn)代藥理研究[3-4]表明，山芝麻具有抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用。β-谷甾醇是山芝麻中的一種甾醇類物質(zhì)，具有降血脂、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[5-6]。目前還未見山芝麻中β-谷甾醇含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過TLC法對(duì)山芝麻中的β-谷甾醇進(jìn)行定性鑒別，并采用HPLC法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，為山芝麻的質(zhì)量控制提供了參考。

1 儀器與材料

LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）;AG135型十萬(wàn)分之一電子天平、AL204型萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特公司）;SK250LHC型超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)公司）。山芝麻對(duì)照藥材（批號(hào)：121088-201103），β-谷甾醇對(duì)照品（批號(hào)：110851-201909，含量以92.7%計(jì)），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院; G型硅膠板（批號(hào)：20180619），青島海洋化工有限公司生產(chǎn);甲醇為色譜純;其余試劑為分析純。山芝麻藥材（批號(hào)：20190401、20190501、20190901）購(gòu)于藥材市場(chǎng)，經(jīng)黔南州檢驗(yàn)檢測(cè)院夏稷子主任藥師鑒定為梧桐科山芝麻Helicteres angustifolia L.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別[7-9]

2.1.1 供試品溶液制備 取山芝麻粉末2.5 g，加30 mL三氯甲烷超聲處理30 min，過濾后的濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)? mL三氯甲烷使其溶解，即得。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液制備 取山芝麻對(duì)照藥材2.5 g，同“2.1.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照藥材溶液。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 取β-谷甾醇對(duì)照品適量，加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.4 鑒別 按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502薄層色譜法試驗(yàn)，吸取以上三種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一G型硅膠薄層板上，置展開劑為石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（5∶ 1）的展開缸內(nèi)展開，取出后晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液并在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視，供試品色譜在與山芝麻對(duì)照藥材色譜和β-谷甾醇對(duì)照品色譜對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，TLC色譜圖見圖1。

2.2 HPLC含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件[10-11] 島津InertSustainR? 〇 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇;柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。在此條件下，β-谷甾醇理論塔板數(shù)大于6000，與相鄰的成分之間達(dá)到基線分離。HPLC色譜圖見圖2。

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 取β-谷甾醇對(duì)照品，加入甲醇制成每1 mL含184.7 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取山芝麻粉末（過三號(hào)篩）約2 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定重量后加熱回流30 min，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜濾過，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL置于2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得系列濃度對(duì)照品溶液。取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液及上述5個(gè)稀釋濃度的溶液測(cè)定峰面積。以β-谷甾醇對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制工作曲線，得回歸方程Y=2676.7X+2649.8（r=0.9999），線性范圍為3.694～184.7 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖3。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下稀釋至10 mL的對(duì)照品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下的條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄β-谷甾醇的峰面積，結(jié)果RSD為0.65%。表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取山芝麻樣品（批號(hào)：20190501），照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8和12 h照“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定β-谷甾醇的含量。結(jié)果其含量的RSD為2.73%。表明供試品溶液在制備后12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取山芝麻樣品（批號(hào)：20190501），照“2.2.3”項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下的條件測(cè)定。結(jié)果測(cè)得6份供試品中β-谷甾醇含量的平均值為0.188 mg/g，RSD為1.84%。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.8 加樣回收率 取β-谷甾醇對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含18.47 μg的加樣回收用儲(chǔ)備液。取山芝麻樣品（批號(hào)：20190501）粉末（過三號(hào)篩）約1 g，精密稱定，精密加入上述加樣回收用儲(chǔ)備液10 mL，再精密加入甲醇15 mL，稱定重量后加熱回流30 min，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜濾過，制得加樣回收供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下的條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算β-谷甾醇的加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.2.9? 樣品測(cè)定 分別取批號(hào)為20190401、20190501 和20190901的山芝麻樣品，各批次均照“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備3份供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下條件，外標(biāo)法測(cè)定β-谷甾醇的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 TLC展開劑比例的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯不同比例（5∶ 1、7∶ 1和9∶ 1）的影響，結(jié)果三種展開劑比例下β-谷甾醇的Rf值分別為0.43、0.30和0.24，當(dāng)展開劑比例為5∶ 1時(shí)，β-谷甾醇Rf值適中，且與相鄰斑點(diǎn)有更好的分離度，故選擇展開劑比例為5∶ 1。

3.2 HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 實(shí)驗(yàn)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)β-谷甾醇進(jìn)行了光譜掃描，結(jié)果在此范圍內(nèi)β-谷甾醇均無最大吸收，在低波長(zhǎng)下有較大吸收。實(shí)驗(yàn)比較了檢測(cè)波長(zhǎng)（205、208和210 nm）的影響，結(jié)果在210 nm下基線較其他兩個(gè)波長(zhǎng)更平穩(wěn)，因此實(shí)驗(yàn)選擇210 nm作為HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 HPLC提取條件的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了提取方式、提取時(shí)間對(duì)樣品中β-谷甾醇提取的影響。在提取時(shí)間均為30 min的情況下，超聲提取所得β-谷甾醇含量為加熱回流提取的84.7%;采用加熱回流提取，不同提取時(shí)間（15、30和45 min）所得β-谷甾醇的含量分別為0.178、0.184和0.185 mg/g。因此，實(shí)驗(yàn)選擇加熱回流提取30 min作為β-谷甾醇HPLC測(cè)定的提取條件。

本實(shí)驗(yàn)建立的TLC方法在3批次山芝麻樣品中重復(fù)性好，所得β-谷甾醇斑點(diǎn)清晰，且與相鄰斑點(diǎn)分離度良好;采用HPLC法測(cè)定β-谷甾醇的含量，方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于山芝麻的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2020-03-30 編輯：劉 斌）

基金項(xiàng)目： 貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目（DBXZYC52029）。

作者簡(jiǎn)介： 陳貴 （1986-），男，漢族，碩士，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：chengui211@126.com