重組結核桿菌融合蛋白(EC)臨床應用專家共識

中國防癆協會 中國防癆協會學校與兒童結核病防治專業分會 《中國防癆雜志》編輯委員會

結核分枝桿菌(MTB)感染和菌陰肺結核的準確診斷是結核病防控的兩個難點和重要問題。重組結核桿菌融合蛋白(EC)[該制品名稱是國家藥典委員會確定的藥品中文通用名稱，“EC”為重組融合蛋白“結核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)”](簡稱“EC”)是通過基因工程方法表達MTB特異的ESAT-6和CFP-10兩種蛋白的融合蛋白，這兩種蛋白在卡介苗菌株中缺失，可誘導特異的遲發型變態反應(DTH)以鑒別MTB感染狀態。在傳染病國家科技重大專項支持下自主研發的EC，已作為新型MTB感染皮膚試驗的檢測試劑通過了國家藥品監督管理局藥品審批而準予上市。在當前我國結核病疫情防控形勢下，EC對MTB感染和菌陰肺結核的診斷具有重要的應用價值。經廣泛征求有關結核病防控、臨床和研究等領域的專家意見，在系統總結相關技術、方法和應用特點的基礎上，結合EC的臨床試驗結果，形成《重組結核桿菌融合蛋白(EC)臨床應用專家共識》。

一、全球結核病疫情形勢

結核病是由MTB感染引起的慢性傳染病，嚴重威脅人類健康，位列全球十大死因之一，是單一傳染病中的頭號殺手[1]。據WHO[1]發布的2019年全球結核病報告，在2018年，全球估算有1000萬例新發結核病患者，結核病平均發病率為130/10萬。耐藥結核病仍然是一項全球公共衛生危機。2018年全球新增約48.6萬例利福平耐藥結核病患者(其中78%為耐多藥結核病)。2018年估算全球因結核病死亡患者共有149.1萬例。在全球范圍內，2000—2018年間，結核病發病率的平均下降率每年僅為1.6%，2015—2018年間累積下降率為6.3%，該下降速度與終止結核病戰略設定的2015—2020年間實現發病率下降20%的目標還相差甚遠。

中國是結核病高負擔國家之一。據WHO[1]估算，2018年中國結核病發病患者例數為86.6萬(發病率為60/10萬)，占全球發病例數的8.7%，位于全球第二位；估算耐利福平患者為6.6萬例，占全球的14%；因結核病而死亡患者為3.7萬例，死亡率為2.6/10萬。2000年全國結核病流行病學抽樣調查對66 456名調查點人群進行結核菌素皮膚試驗(TST)檢查，硬結平均直徑≥10 mm者占28.3%[2]，按照國際上將硬結平均直徑≥10 mm與γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assays，IGRA)陽性作為潛伏性結核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)的診斷標準[3]，估算全國結核感染人數為3.6億。Gao等[4]在2013年對21 022名5歲以上農村常住人口進行LTBI的流行病學研究，調查對象中IGRA檢測的陽性率為18.9%，據此估算全國結核感染人數為3.5億。為此，研究結核感染診斷新技術、新方法對加速結核病疫情下降、實現終止結核病目標具有十分重要的意義。

二、結核感染與發病

LTBI的定義是一種對MTB抗原刺激具有持續免疫反應的狀態，但沒有活動性結核病的臨床表現證據，有時也叫結核感染[5]。LTBI沒有病原學診斷依據，只能通過檢測機體的免疫反應來診斷[6]。LTBI人群是一個龐大的潛在患者庫，LTBI者中平均5%～10%的人會在一生中發生活動性結核病；對于HIV感染陽性的LTBI患者，其每年進展為活動性結核病的發病率約為10%，一生中約有50%的概率會發生活動性結核病[7]。這些新發患者再進一步傳播產生新的感染者。2015年WHO[8]提出終止結核病策略，其目標是到2035年全球結核病發病率下降到10/10萬以下，首次提出了要在高危人群中系統開展LTBI的檢測和預防性干預，減少結核發病；并指出如果LTBI問題不解決，終止結核病目標不可能實現。《中國結核病預防控制工作技術規范(2020年版)》[9]將結核感染檢測和預防納入結核病預防治療的重要內容。

結核病診斷的另一個瓶頸是菌陰肺結核的診斷，而兒童結核病多表現為菌陰肺結核。據統計，菌陰肺結核約占所有肺結核患者的70%左右[10]。我國發布的《WS 288—2017 肺結核診斷》[11]中，將TST、IGRA和血清抗體檢測都納入了肺結核輔助診斷的方法，其目的是通過提供結核感染證據提高菌陰肺結核的診斷水平。EC是主要針對解決LTBI診斷和菌陰肺結核的輔助診斷等問題而研發的新產品。

三、 現行結核感染的免疫學檢測方法

人體是否感染了MTB，因沒有檢查方法和技術證實在機體隱匿的MTB，故一般說LTBI的診斷缺乏“金標準”[12]。通常，對LTBI的診斷，是通過檢測機體對結核感染的特異性免疫，來反映機體是否受MTB感染。現行檢測LTBI的免疫學診斷技術包括TST、IGRA和抗原抗體檢測等。各種檢測方法因其檢測反應的原理不一致，臨床使用特點也不相同。

(一) TST

TST是基于Ⅳ型DTH的一種皮膚試驗，常用的反應原是純蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)。TST的特點是操作簡單，不需要特殊設備和實驗室，是臨床上廣泛使用的輔助診斷的免疫學方法，是WHO[13]發布的對LTBI的篩查指南和我國發布的《兒童結核分枝桿菌潛伏感染篩查和預防性治療專家共識》[14]均推薦的技術。我國1979—2000年進行的4次全國結核病流行病學調查都采用TST作為兒童結核感染篩查的手段[2，15-17]。在我國2017年公布的《WS 288—2017 肺結核診斷》[11]中，TST也作為菌陰肺結核的輔助診斷方法。由于PPD有200多種抗原成分，與卡介苗和非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacterium，NTM)有大量相同或相似的抗原成分，導致TST很容易發生交叉反應[18]。因此，TST出現假陽性的可能性較大，特別是在NTM的高流行地區。有專家認為，前次進行TST可能導致再次檢查時出現假陽性結果[19]，因此TST被認為不適合用于結核感染的連續監測。

(二)IGRA

機體感染MTB以后，血液中存在著特異的效應T 淋巴細胞。當機體再次接觸MTB特異性抗原時，效應T 淋巴細胞將特異性地產生和分泌γ干擾素(IFN-γ)，通過定量檢測釋放的IFN-γ的水平或計數，來判定患者是否存在LTBI[20]。IGRA檢測采用分枝桿菌蛋白質的多肽抗原(包括ESAT-6、CFP-10和TB7.7)，刺激效應淋巴細胞分泌IFN-γ，檢測并定量分析IFN-γ的濃度，判斷是否存在MTB特異性細胞免疫反應[21]。所有卡介苗菌株和絕大部分的NTM 都不含有這3種蛋白質[22]，因此保障了其良好的檢測特異度。該試驗為體外免疫診斷試驗，需要收集人體外周全血在實驗室特定的儀器上進行檢測；需要一定的實驗室條件支撐，且高通量檢測受限，基層大規模篩查存在一些困難；同時價格昂貴，在一定程度上限制了其使用。由于其特異度較高，在臨床菌陰肺結核和肺外結核的個體確認方面具有較高的應用價值。有些國家在LTBI篩查中先用TST檢測，對TST 陽性者再進行IGRA檢測[23]。

(三) 抗原抗體檢測

自1898年Arloing等檢測血清結核抗體獲得成功以來，人們一直沒有停止對結核抗原抗體檢測技術的研究[24]。結核抗體檢測的基本原理是采用已知的結核特異性抗原，來檢測待檢標本中所含的特異性抗體。由于檢測結核抗體的方法不同，儀器設備也不同，各產品的敏感度和特異度也不同[25]。該方法也已納入我國《WS 288—2017肺結核診斷》[11]，作為菌陰肺結核的輔助診斷技術。

四、EC臨床試驗研究

對EC研究的目的，旨在目前使用的免疫學診斷技術的基礎上，研發出敏感度高、特異度強、操作簡單、可用于LTBI和菌陰肺結核診斷的新產品和新技術。

(一) EC的生物學特征

EC系由大腸埃希菌高效表達MTB的ESAT-6與CFP-10的融合蛋白基因，經發酵、分離和純化后獲得的融合蛋白(EC蛋白)制成。ESAT-6蛋白和CFP-10蛋白具有良好的免疫活性，可以刺激T細胞增殖，誘導T細胞釋放IFN-γ，誘發DTH。Lalvani[26]和Chapman等[27]對不同人群進行了ESAT-6蛋白的表位研究，結果發現ESAT-6具有多個T淋巴細胞表位，且大多為CD4表位。Spencer等[28]分析CFP-10抗原表位，按氨基酸序列合成18條肽段(P1～P18)，相鄰2個肽段重疊5個氨基酸，實驗發現人類識別的T淋巴細胞表位較多。Lewinsohn等[29]的另一項研究表明，CFP-10蛋白還含有2個CD8+T細胞表位，即CFP-1085-94和CFP-102-11，這2個識別表位分別嚴格受限于人類白細胞抗原(HLA)-B14和HLA-B44型。抗原表位的研究表明ESAT-6和CFP-10蛋白均具有多個T細胞表位。

(二)EC制劑成分

本品主要成分為EC，含適宜穩定劑，不含抗生素。每1 ml含50 U重組EC的稀釋制劑。輔料成分包括磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、苯酚、聚山梨酯80。

(三) EC臨床試驗研究設計

根據《中華人民共和國藥典(2010年版)》[30]有關要求，參照《人用重組DNA制品質量控制技術指導原則》[31]及相關標準，臨床試驗研究設計與評價基于以下原則：(1)該試劑應能誘導結核病患者產生DTH；與非結核病患者陽性檢出率差異應有統計學意義，與功能相同的IGRA檢測結果差異無統計學意義。(2)對EC、PPD、IGRA三種手段檢測陰性人群接種卡介苗或安慰劑后，該試劑應不誘導產生DTH；對其中的卡介苗接種者，該試劑與PPD誘導產生DTH的陽性反應率差異有統計學意義，該試劑與功能相同的IGRA檢測結果差異無統計學意義。(3)該臨床研究入組人群與丹麥血清研究所(Statens Serum Institut,SSI)同類產品臨床研究入組人群基本一致。包括結核病患者、卡介苗接種者與健康志愿者，評價標準也以臨床診斷為基本標準，以TB-PPD和T-SPOT.TB檢測為對照。

(四)不同方法檢測的陽性結果判斷標準

1. EC：0.1 ml(5 U)，采取孟都法注射于前臂掌側皮內，注射后48～72 h檢查注射部位反應，測量并記錄紅暈和硬結的橫徑及縱徑的長度(mm)，以紅暈或硬結大者為準，反應平均直徑[(橫徑+縱徑)/2)] ≥5 mm為陽性反應。凡有水皰、壞死、淋巴管炎者均屬強陽性反應。

2. TST：采用TB-PPD 0.1 ml(5 U)，采取孟都法注射于前臂掌側皮內，注射后48～72 h檢查注射部位反應，測量記錄硬結的橫徑及縱徑的長度(mm)，以硬結為準，反應平均直徑[(橫徑+縱徑)/2)] ≥6 mm為陽性反應。凡有水皰、壞死、淋巴管炎者均屬強陽性反應。

3. IGRA：采用T-SPOT.TB檢查，根據抗原A和(或)抗原B孔的反應判斷結果(抗原A：ESAT-6；抗原B：CFP-10)；檢測結果為“有反應性(陽性)”應參照以下標準判定：空白對照孔斑點數為 0～5 個時，且抗原A或抗原B孔的斑點數減去空白對照孔斑點數≥6；空白對照孔斑點數為6～10個時，且抗原 A 或抗原B孔的斑點數≥2倍空白對照孔斑點數。如果上述標準不符合且陽性對照孔符合質量控制標準時，檢測結果為“無反應性(陰性)”。

五、EC臨床試驗研究結果

前期開展了Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗評估EC的安全性，以及在人群中的耐受性研究，并在中國人群中進行了初步的劑量探索。在Ⅱ期臨床試驗中發現，EC的主要不良反應是局部瘙癢(8.3%，12/144)和疼痛(18.1%，26/144)，沒有嚴重不良反應發生。據此得出結論：EC用于診斷結核感染時受檢者耐受性尚可且安全[32-33],在此基礎上，進一步開展了Ⅲ期臨床試驗。

(一)健康人群流行病學篩查的陽性檢出率

采用EC、TB-PPD和T-SPOT.TB對1559名健康受試者進行臨床流行病學篩查對照試驗，陽性檢出率分別為10.46%(163/1559)、53.69%(837/1559)和19.11%(298/1559)。3種試劑檢測結果兩兩一致率比較分析：EC與T-SPOT.TB、EC與TB-PPD，以及TB-PPD與T-SPOT.TB結果之間的陰性符合率分別為88.77%(1384/1559)、55.23%(861/1559)和58.24%(908/1559)。EC與T-SPOT.TB對健康人群篩查結果具有較高的一致性；TB-PPD受卡介苗接種和NTM影響，陽性率高。

(二)結核感染的敏感度試驗

791例臨床診斷為結核病患者的研究結果顯示：EC的診斷敏感度為90.64%(717/791)，T-SPOT.TB的診斷敏感度為91.15%(721/791)，TB-PPD的診斷敏感度為90.90%(719/791)。EC與T-SPOT.TB間敏感度的差值(95%CI)為-0.51%(-2.39%～1.36%)；EC與TB-PPD間敏感度的差值(95%CI)為-0.26%(-2.36%～1.80%)，95%CI下限均大于-10%(表1)。3種方法均具有良好的敏感度，且3種方法相互之間一致性高。

表1 不同結核感染患者對3種檢測方法的敏感度

(三)結核感染陰性結果的一致性檢驗

1564名健康受試者分別進行EC、T-SPOT.TB、TB-PPD檢測。將479名3種方法檢測均為陰性的人員作為未感染結核者；對318名接種卡介苗(2例結果缺失)，161名接種卡介苗安慰劑。161名卡介苗安慰劑接種者重復檢測的臨床研究結果顯示：EC 2次檢測陰性結果的一致率為88.20%(142/161)，T-SPOT.TB為93.17%(150/161)，TB-PPD為60.87%(98/161)。EC與T-SPOT.TB間2次檢測一致率的差值(95%CI)為-4.97%(-9.32%～-0.62%)，95%CI下限大于-10%。EC與TB-PPD間特異度的差值(95%CI)為27.33%(19.25%～35.40%)，95%CI下限大于0.00%。EC與T-SPOT.TB在未感染結核人群的陰性符合率高(特異度高)，且兩者之間的一致性高；受卡介苗接種和NTM感染的影響，在未感染結核人群中，TB-PPD的陰性符合率低(特異度低)，TB-PPD與T-SPOT.TB、TB-PPD與EC的一致性差。

(四)卡介苗接種后診斷結核感染的特異度試驗

將1564名健康受試者分別進行EC、T-SPOT.TB、TB-PPD檢測，其中479名3種方法檢測均為陰性人員中，有318名接種了卡介苗(2例結果缺失)，161名接種了卡介苗的安慰劑。3個月后再次分別進行EC、T-SPOT.TB、TB-PPD檢測，結果顯示：EC在該人群中的陰性符合率為92.72%(293/316)，T-SPOT.TB的陰性符合率為95.25%(301/316)，TB-PPD的陽轉率為73.42%(232/316)，陰性符合率為26.58%(84/316)。EC與T-SPOT.TB陰性符合率的差值(95%CI)為-2.53%(-5.06%～0.00%)，95%CI下限大于-10%。EC與TB-PPD間陰性符合率的差值(95%CI)為66.14%(60.76%～71.52%)，95%CI下限>0.00%。該研究結果顯示，EC、T-SPOT.TB基本不受卡介苗接種的影響；TB-PPD在卡介苗接種后陽轉率高，在檢測結核感染時特異度差，但是TB-PPD可用來監測卡介苗接種的效果。

(五)非結核性其他疾病患者的陰性符合率

394例臨床診斷為非結核性其他疾病患者的臨床研究結果顯示：EC檢測的陰性符合率為73.10%(288/394)；T-SPOT.TB檢測的陰性符合率為78.68%(310/394)；TB-PPD檢測的陰性符合率為59.64%(235/394)。

以上研究顯示：EC、TB-PPD和T-SPOT.TB在進行結核病的輔助診斷及其他非結核性疾病的鑒別診斷時，EC和T-SPOT.TB特異度較TB-PPD高，且EC與T-SPOT.TB的一致性較好。

六、EC的臨床應用建議

(一)使用對象

EC皮膚試驗結果不受卡介苗接種的影響，適用于結核感染和輔助結核病的臨床診斷。按照說明書推薦，適用于≥6月齡嬰兒、兒童及<65周歲成人。

(二)使用方法

1．EC單獨使用：吸取本品0.1 ml(5 U)，采取孟都法注射于前臂掌側皮內。注射后48～72 h檢查注射部位反應，測量記錄紅暈和硬結的橫徑及縱徑的長度(mm)，以紅暈或硬結大者為準，反應平均直徑[橫徑+縱徑)/2]≥5 mm為陽性反應。凡有水皰、壞死、淋巴管炎者均屬強陽性反應。

2．EC與PPD聯用：分別吸取EC 0.1 ml(5 U)與PPD 0.1 ml(5 IU)，先采取孟都法于左前臂掌側皮內注射EC，觀察5 min無異常后在右前臂掌側皮內注射PPD。于注射后48～72 h檢查雙臂注射部位反應。EC以紅暈或硬結大者為準，PPD以硬結為準。測量記錄紅暈和硬結的橫徑和縱徑的長度(mm)，以紅暈或硬結平均直徑≥5 mm為陽性反應。凡有水皰、壞死、淋巴管炎者均屬強陽性反應。

(三)結果判讀和臨床意義

1. 單獨使用EC檢測結果的臨床意義：見表2。

表2 單獨使用EC檢測結果的臨床意義

2. 同體雙臂使用EC及PPD檢測結果的臨床意義：見表3。

表3 同體雙臂使用EC和PPD檢測結果的臨床意義

(四)使用范圍

1. LTBI篩查和流行病學調查：(1)結核病患者密切接觸者(家庭、學校、醫療機構、社區、聚集性疫情等)的LTBI篩查。(2)在結核病高風險人群、重點人群[HIV感染人群、腫瘤壞死因子(TNF)拮抗劑使用人群、器官移植人群、血液透析人群、塵肺人群、糖尿病患者、風濕病患者、羈押人員、流浪者、外來務工人員、社區中老年人群、其他免疫力低下人群等]中的LTBI篩查。(3)全人群中LTBI的流行病學調查。

2. 肺結核和肺外結核的輔助診斷：EC檢測的特異度高，對肺結核和肺外結核的輔助診斷具有較好的參考價值。因操作快速簡便，適宜于各級醫療衛生機構開展肺結核診斷和鑒別診斷使用，提高肺結核診斷的準確性。

3. EC在預防性干預技術路徑中的應用價值：通過聯用EC與PPD，可以根據皮膚試驗結果區分人群的MTB感染狀態，解決了當PPD陽性時無法區分陽性是由于接種了卡介苗還是感染了MTB的弊端；這在結核病的預防人群分類中有較好的作用。這些人群包括卡介苗接種后仍然維持陽性者、陰轉者和LTBI者。對結核病高發的卡介苗接種地區進行LTBI的篩查，需要簡單易行的方法將結核病預防目標人群精準區分，為構建完整的結核病免疫預防治療體系提供科學依據、創造可行性。

不同人群的結核感染狀態不同，可通過EC+PPD的聯合檢測結果加以區分：(1)EC結果呈陽性、PPD陽/陰性者，將可通過化學藥品預防和(或)使用已獲批用于治療LTBI的疫苗進行預防，防止結核感染者進一步發展成結核病；(2)對于EC結果呈陰性且PPD陰性者，使用成人卡介苗進行預防；(3)對于EC結果呈陰性且PPD陽性者，使用加強免疫用疫苗防止再感染MTB(圖1)。

圖1 預防結核病的人群分類及干預方法

七、展望

EC作為新型MTB感染皮膚試驗的檢測試劑，在人群中使用具有良好的安全性，診斷結核感染的敏感度和特異度均較高，檢測技術成本較低、操作簡單，可用于LTBI和菌陰肺結核的診斷。EC具備了其他結核感染檢測方法的優點，同時作為一種皮膚檢測試劑，不僅降低了LTBI篩查和流行病學調查的成本，而且易于在基層推廣，這對結核病的控制有重大意義，在預防性干預技術路徑中具有廣闊的應用前景。EC上市是中國結核病防控體系的一個重大突破。但EC作為新產品和新技術在人群中的安全性和應用價值有待進一步觀察和評估。同時EC在LTBI高危人群和<6月齡嬰兒中的應用數據缺乏，在各種臨床或其他因素造成免疫功能低下的人群，以及與肺結核患者密切接觸的人群，其安全性和有效性尚有待進一步考證。

執筆者201508 上海市公共衛生臨床中心(盧水華)；210009 南京，江蘇省疾病預防控制中心(陸偉)

參與討論與撰寫本共識的單位與作者(排名不分先后) 102629 北京，中國食品藥品檢定研究院(徐苗)； 100176 北京，中國醫學科學院病原生物學研究所(金奇、高磊)；101149 首都醫科大學附屬北京胸科醫院(初乃惠)；100069 首都醫科大學附屬北京兒童醫院(申阿東)；200051 上海市疾病預防控制中心(沈鑫)；200433 同濟大學附屬上海市肺科醫院(沙巍)；201508 上海市公共衛生臨床中心(李濤、范小勇)；300350 天津大學天津市海河醫院(吳琦)；210009 南京，江蘇省疾病預防控制中心(朱鳳才)；410013 長沙，湖南省結核病防治所(白麗瓊)；230001 合肥，安徽省立醫院(梅曉冬)；400016 重慶醫科大學附屬第一醫院(郭述良、黎友倫)；430000 武漢金銀潭醫院(張定宇、黃朝林、魏明)；430030 武漢市肺科醫院(王衛華、袁保東)；214073 江蘇省無錫市第五人民醫院(黃利華、歐勤芳)；350008 福建省福州肺科醫院(陳曉紅)；518112 深圳市第三人民醫院(鄧群益)；212021 江蘇省鎮江市第三人民醫院(潘洪秋)；710100 西安，陜西省結核病防治院(仵倩紅、賀晨艷)

學術秘書201508 復旦大學附屬上海市公共衛生臨床中心(楊恒)

指導專家肖和平 王國治