重組結核桿菌融合蛋白(EC)的免疫特性和臨床前安全性研究

張凱 陶立峰 韋芬 都偉欣 仇晶晶 陳偉 陳保文 朱銀猛 程興 蘇城 鐘再新 盧錦標 蒲江

肺結核是由結核分枝桿菌感染引起的嚴重危害人類健康的疾病。據WHO[1]估計，全球潛伏性結核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)人群約17億，約占全人群的1/4左右。2018年全球結核病新發患者約1000萬例，約145萬例死于結核病[2]。WHO[3]提出了2035年“終止結核病”戰略目標，將結核病發病率控制在10/10萬以下。WHO 2018年發布的LTBI管理指南及關于結核病發病率低的國家及地區消滅結核病的新框架文件中，都將LTBI者的篩查與預防作為控制結核病疫情的重要手段[4]。因此，如何簡便、高通量診斷結核感染者并實施預防是結核病防治工作的關鍵。

差異區域1(region of difference-1，RD-1)是結核分枝桿菌在長期傳代過程中丟失的重要保護性抗原，RD-1僅存在于致病性分枝桿菌中，而在卡介苗及環境分枝桿菌中缺失。目前，國內外均以RD-1基因編碼的結核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)為研究熱點[5]，制成的結核感染鑒別用變態反應原皮膚試驗(IST)，既有γ-干擾素釋放試驗(IGRA)特異性又有結核菌素皮膚試驗(TST)適合大規模篩查的簡便性，是極具潛力的新一代結核分枝桿菌感染篩查試劑。本研究的重組結核桿菌融合蛋白(EC)(該制品名稱是國家藥典委員會確定的藥品中文通用名稱，“EC”為重組融合蛋白“ESAT-6和CFP-10”)(簡稱“EC”)，有望應用于結核分枝桿菌感染的診斷和結核病的輔助診斷。

資料和方法

一、 材料

(一) 菌株

結核分枝桿菌H37Ra，上海復旦大學三級安全防護實驗室提供并開展相關試驗；卡介菌，安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司提供。

(二) 主要試劑

EC原液，安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司生產；TB-PPD (50 IU/ml，批號：20171010)，北京祥瑞生物制品有限公司生產。

(三) 實驗動物

無特殊病原體(specific pathogen free，SPF)級白色豚鼠，34只，雌性22只，雄性12只，體質量300～400 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；新西蘭兔，6只，雌雄各半，體質量2 ～3 kg，由浙江省實驗動物中心提供；ICR[(美國)Institute of Cancer Research]小鼠，80只，雌雄各半，體質量17～19 g，由浙江省實驗動物中心提供。

二、方法

(一) 遲發型超敏反應試驗

1. 動物篩選(TB-PPD)皮膚試驗：將體質量合格豚鼠背部局部去毛，用酒精棉消毒去毛部位皮膚，用1 ml注射器吸取 50 IU/ml 的TB-PPD，在去毛部位皮內注射 0.2 ml TB-PPD，注射部位應有皮丘凸起，旋轉180°拔出針頭。于注射后48 h觀察局部硬結或紅暈反應的縱徑與橫徑(以硬結或紅暈反應大者為準)，平均硬結或紅暈反應直徑[(縱徑+橫徑)/2]≥5 mm判為陽性，<5 mm判為陰性；TB-PPD 皮膚試驗陰性豚鼠留做試驗用。

2. 效價測定：選取6只經TB-PPD皮膚試驗陰性的300～400 g SPF級雌性豚鼠，每只豚鼠大腿腹股溝內側皮下注射結核分枝桿菌H37Ra活菌菌液0.5 ml，致敏5周后，將豚鼠背部脊柱兩側去毛，去毛后每只豚鼠于背部脊柱兩側以輪圈法皮內注射2.5 μg/ml EC原液0.2 ml。于注射后24 h觀察局部硬結或紅暈的縱徑與橫徑(以硬結或紅暈反應大者為準)，平均硬結或紅暈反應直徑[(縱徑+橫徑)/2]≥5 mm判為陽性，<5 mm判為陰性。

3. 鑒別試驗：選取4只經TB-PPD皮膚試驗檢測陰性的300～400 g SPF級雌性豚鼠，豚鼠大腿腹股溝內側皮下注射卡介菌活菌菌液0.5 ml，致敏5周后，將豚鼠背部脊柱兩側去毛，去毛后每只豚鼠于背部脊柱兩側以輪圈法皮內注射20 μg/ml EC原液和50 IU/ml TB-PPD各0.2 ml，于注射后48 h觀察局部硬結或紅暈的縱徑與橫徑(以硬結或紅暈反應大者為準)，平均硬結或紅暈反應直徑[(縱徑+橫徑)/2)]≥5 mm判為陽性，<5 mm判為陰性。

(二) EC臨床前安全性研究

將EC原液送浙江省醫學科學院安全性評價研究中心進行急性毒性試驗、豚鼠全身主動過敏試驗和兔皮內刺激試驗進行臨床前安全性研究。

1. 急性毒性試驗：取80只健康ICR小鼠，分為背部皮膚單次單點肌內注射組和皮內注射組，每組40只，雌雄各半；每組再分為4組，每組10只，雌雄各半。高劑量組(注射EC 53.61 μg/0.1 ml)、低劑量組(注射EC 0.2 μg/0.1 ml)、溶劑對照組(注射EC稀釋液0.1 ml)、空白對照組(不給予任何受試物)。給藥前禁食，給藥后立即觀察小鼠的外觀、運動功能、排便、尿、皮膚、口、眼、鼻等一般情況。給藥第一天每隔0.5 ～1.0 h觀察1次，以后每天觀察1次，連續觀察14 d。在此期間，觀察記錄所有出現的癥狀、癥狀起始時間、嚴重程度、持續時間及死亡分布情況，并在0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、8 d、10 d、12 d、14 d稱量小鼠體質量。試驗結束后，將小鼠通過頸椎脫臼安樂處死，并進行大體解剖，觀察各臟器和藥物注射部位皮膚是否有異常病變。

2. 豚鼠全身主動過敏試驗：取健康無傷白色普通級豚鼠24只，分為4組，每組6只，雌雄各半，各組豚鼠分別隔日腹腔注射高劑量(5 μg/kg)、低劑量(0.5 μg/kg)EC，牛血清白蛋白(60 mg)(陽性對照組)和0.9%NaCl(質量分數為0.9%的NaCl溶液)注射液(2 ml)(陰性對照組)，連續3次。致敏結束，末次致敏后第12天靜脈快速注射2倍致敏劑量對以上相應的各組致敏豚鼠進行激發。致敏期間，每天觀察豚鼠的癥狀，并于初次和最后一次致敏及激發當日測定豚鼠的體質量。靜脈注射激發后即刻至30 min，觀察并記錄豚鼠反應癥狀，并評價豚鼠全身致敏反應，過敏反應陰性(-)：正常；過敏反應弱陽性(+)：出現不安寧、豎毛、發抖、搔鼻；過敏反應陽性(++)：出現噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排糞、流淚；過敏反應強陽性(+++)：出現呼吸困難、哮鳴音、皮膚紫癜、步態不穩、跳躍、喘息、痙攣、旋轉、潮式呼吸；過敏反應極強陽性(++++)：死亡。

3. 兔皮內刺激試驗：取健康皮膚無傷新西蘭兔6只，試驗前24 h，剃毛刀剔除每兔脊椎兩側的毛。兔背部左右側去毛區分別單次皮內注射EC 10 μg(0.2 ml)/點和相同容量的0.9% NaCl(質量分數為0.9%的NaCl溶液)注射液0.2 ml/點劑量，每側5個點，每點間隔2 cm，注射后即刻、24 h、48 h和72 h 觀察注射局部及其周圍皮膚組織反應，包括紅斑、水腫和壞死等。于末次給藥后72 h由耳靜脈注入空氣處死兔，解剖觀察注射部位的皮膚組織的變化，并進行病理組織學檢查。

三、 統計學處理

結 果

一、 遲發型超敏反應試驗

EC原液誘導結核分枝桿菌H37Ra活菌致敏豚鼠的24 h皮膚試驗，陽性為6只(表1)；TB-PPD誘導卡介菌活菌致敏豚鼠的48 h皮膚試驗，陽性為4只；EC誘導卡介菌活菌致敏豚鼠的48 h皮膚試驗，陽性為0只(表2)。

表1 EC對結核分枝桿菌H37Ra活菌致敏豚鼠遲發型超敏反應試驗結果

二、 急性毒性試驗結果

在整個試驗過程中，高劑量組、低劑量組、溶劑對照組、空白對照組小鼠的外觀、運動功能、排便、排尿、皮膚、口、眼、鼻等一般情況未出現任何異常反應和死亡。小鼠皮內注射EC在不同觀察時間點，即注射前、注射后1 d、3 d、5 d、7 d、8 d、10 d、12 d、14 d EC高劑量組、低劑量組小鼠平均體質量分別為(20.6±1.3) g～(24.9±2.1) g、(20.5±1.6) g～(26.0±3.1) g；注射后不同觀察時間各組平均體質量和相應時間的空白對照組[(21.0±1.1) g～(25.3±2.3) g]比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表3)。小鼠肌內注射EC在不同觀察時間點，即注射前、注射后1 d、3 d、5 d、7 d、8 d、10 d、12 d、14 d EC高劑量組、低劑量組小鼠平均體質量分別為(21.0±1.5) g～(26.2±1.9) g、(20.5±2.1) g～(25.8±3.8) g；注射后不同觀察時間各組平均體質量和相應時間的空白對照組[(21.2±1.7) g～(25.8±3.1) g]比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表4)。試驗結束后解剖所有試驗小鼠，各臟器和藥物注射部位皮膚均未發現任何肉眼可見的異常病變。

表3 皮內注射EC前后不同觀察時間各組小鼠的體質量比較

表4 肌內注射EC前后不同觀察時間各組小鼠的體質量比較

三、 豚鼠全身主動過敏試驗結果

各試驗組豚鼠在致敏期間均未見明顯異常反應，體質量也均隨試驗時間延長而增加。高劑量組、低劑量組豚鼠首次致敏、末次致敏、激發時的平均體質量分別為(327.5±24.3) g、(347.2±32.7) g、(402.2±34.9) g；(331.3±26.7) g、(346.2±32.0) g、(411.3±38.9) g，與相應時間的0.9% NaCl注射液陰性對照組[(329.5±27.4) g、(348.3±27.0) g、(399.4±25.4) g]比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表5)。末次致敏后第12天給予激發劑量后，高劑量組、低劑量組與相應時間陰性對照組均無過敏反應發生。而陽性對照組豚鼠均出現明顯的過敏反應癥狀，主要表現為不安寧、豎毛、發抖、搔鼻、噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、流淚、呼吸困難、步態不穩、跳躍、痙攣，甚至死亡，死亡時間在給藥后5 min左右，有過敏反應的存活豚鼠在給藥后30 min內逐漸恢復正常，其發生過敏反應的豚鼠有6只，死亡數為3只，過敏反應為極強陽性(表6)。

表5 注射EC全身主動過敏試驗致敏后不同時間各組豚鼠的體質量比較

表6 EC不同劑量組豚鼠全身主動過敏試驗結果

四、 兔皮內刺激試驗結果

兔背部分別單次皮內注射0.9%NaCl、 EC后，在各觀察時間點均未見皮膚紅斑、水腫現象。停藥72 h后解剖，可見兔左、右側給藥局部皮膚色澤均勻、紅潤，無紅斑、水腫、突起、潰瘍等異常。鏡下檢查，兔左、右側給藥局部皮膚各層均未見充血、水腫、變性和炎性浸潤等病理變化(圖1，2)。

皮膚各層未見充血、水腫、變性和炎性浸潤等病理變化圖1 兔皮內注射0.9%NaCl注射液后局部皮下組織學切片(HE ×400)

皮膚組織結構正常，各層未見充血、水腫、變性和炎性浸潤等病理變化圖2 兔皮內注射EC后局部皮下組織學切片(HE ×400)

討 論

結核病作為單病因致死率最高的傳染性疾病，由于人口流動、耐藥結核分枝桿菌和結核分枝桿菌與人獲得性免疫缺陷病毒雙重感染等因素，結核病防治工作面臨巨大的挑戰[6]。因此，如何早期發現高危人群并給予預防是結核病控制的重要問題，而其中尋找能診斷和確定患者體內是否留有存活結核分枝桿菌應該是實現的關鍵。目前對于LTBI患者的診斷手段主要有IGRA及PPD皮膚試驗，但IGRA檢測費用昂貴、檢測技術高等實際問題，難以在結核病高發的發展中國家實施；PPD皮膚試驗不能有效區分卡介苗接種與結核感染，更不能鑒別結核感染者體內有無存活的結核分枝桿菌[7]。因此，研制一種特異性強、方便使用的結核病診斷試劑對控制我國結核病傳染具有重要價值。

結核分枝桿菌生長期間分泌的蛋白對結核病的保護性免疫作用非常重要。迄今為止，大量結核分枝桿菌的抗原被作為結核病疫苗的候選蛋白。據報道，現已用基因工程技術研究了分枝桿菌的多種抗原蛋白，比如CFP-10、ESAT-6和Ag85家族蛋白[8-9]。ESAT-6蛋白誘導機體產生明顯的T細胞免疫應答和釋放高水平γ-干擾素(IFN-γ)，具有良好的抗原刺激性并能被大多數結核病患者所識別；CFP-10與ESAT-6 同屬于ESAT-6家族，也是免疫優勢抗原，能誘導機體產生免疫應答。

根據Swissprot和GenBank數據庫資料分析，ESAT-6和CFP-10基因嚴格限制于結核分枝桿菌復合群和4種非結核分枝桿菌(堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、微黃分枝桿菌和蘇加分枝桿菌)中，卡介苗和大部分非結核分枝桿菌缺失[10-12]，因此ESAT-6和CFP-10蛋白不受卡介苗和絕大多數環境分枝桿菌的影響，具有很好的特異性。EC對結核分枝桿菌H37Ra活菌致敏豚鼠的皮膚試驗，陽性為6只；對卡介菌活菌致敏豚鼠的皮膚試驗，陽性為0只。遲發型超敏反應試驗表明，EC能夠鑒別結核感染與卡介苗免疫。

臨床前動物安全性研究表明，采用不同注射方式(單次皮內注射和單次肌內注射)，EC在每只鼠注射高劑量(53.61 μg)和等效劑量(0.2 μg)的條件下，所有小鼠未出現明顯的急性中毒反應和顯示有急性中毒的靶器官。采用3次腹腔注射致敏和1次靜脈注射激發的模式，豚鼠在致敏期間均未見明顯異常反應，體質量隨試驗時間延長而增長；激發后，注射EC高劑量組、低劑量組均無過敏反應發生，表明EC對豚鼠無過敏反應。采用單次皮內注射方式，EC在試驗劑量[10 μg(0.2 ml)/點，每側5個點]條件下，對兔皮內無明顯刺激反應。 EC臨床前動物試驗安全性好，能夠鑒別結核感染與卡介苗免疫，有望應用于人群結核感染的診斷與鑒別診斷。