重組結核桿菌融合蛋白(EC)產品質量標準的建立

張凱 沈小兵 陶立峰 韋芬 陳保文 仇晶晶 陳偉 盧錦標 朱銀猛 程興 鐘再新 趙愛華 蒲江

質量標準的建立、研究及評估是新藥研究的主要內容之一。新藥研發過程中需要結合產品特性，對其質量進行系統和深入的研究，并由此制定出合理和可行的質量標準，以確保藥品質量的穩定、安全及有效性。重組結核桿菌融合蛋白(EC)[該制品名稱是國家藥典委員會確定的藥品中文通用名稱，“EC”為重組融合蛋白“結核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)”](簡稱“EC”)是安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司生產的一種新型皮膚試驗體內診斷試劑，可以用于檢測結核分枝桿菌感染、輔助結核病臨床診斷、鑒別卡介苗(BCG)接種與結核分枝桿菌感染。同時，可與結核菌素純蛋白衍生物聯合用于不同免疫與感染背景BCG接種者篩選。本研究建立了重組EC原液及成品的質量控制(簡稱“質控”)方法和質量標準，并對EC原液和成品進行了檢定，現報告如下。

材料和方法

一、材料及試劑

1.實驗材料：EC原液及成品均由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司研制，其中，EC原液共6批次，批號分別為M20170902、M20170903、M20171001、M20171101、M20171102、M20171201；EC成品共11批次，0.3 ml/瓶(15 U)規格的批號分別為20171102、20171205、20171208、20180102；0.5 ml/瓶(25 U)規格的批號分別為20171101、20171204、20171205、20180101；1.0 ml/瓶(50 U)規格的批號分別為20171203、20171206、20171209。

2.實驗動物：無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級白色豚鼠，體質量300～400 g，共21只，其中雌性豚鼠18只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

3.實驗菌株：BCG活菌菌液，濃度為1 mg/ml，由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司制備。結核分枝桿菌減毒株H37Ra活菌菌液，濃度為2 mg/ml，由復旦大學三級安全防護實驗室提供。

4.主要試劑：TB-PPD購自北京祥瑞生物制品有限公司；EC原液效力評價用參考品、EC成品效力評價用參考品及EC原液理化檢定用參考品均由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司提供；增強型辣根過氧化物酶(HRP-DAB)底物顯色試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產品；濾紙和硝酸纖維素膜為德國Millipore公司產品；EC兔多抗由中國食品藥品檢定研究院提供；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG為北京中杉金橋生物技術有限公司產品；大腸埃希菌宿主殘留蛋白檢測試劑盒購自美國Cygnus公司；卡那霉素殘留量檢測試劑盒購自北京勤邦生物技術有限公司。

二、質量標準的建立

(一)EC原液質量標準的建立

EC原液中“殘余抗生素活性”“致敏效應試驗”“效價測定”及“動物法鑒別實驗”方法及標準為本研究自建方法，其余檢測項依據《中國藥典》2015年版(三部)建立。

1.殘余抗生素活性檢測：分別吸取卡那霉素殘留量檢測試劑盒中標準品和EC原液20 μl加至酶標板的微孔中，標準品和EC原液均做2個平行孔，然后加入酶標二抗50 μl/孔，再加入抗體工作液80 μl/孔，振蕩混勻，25 ℃避光反應40 min。洗滌液洗板5次。分別以50 μl/孔加入底物液A液、底物液B液，25 ℃避光反應15 min。若顯色顏色較淺，可適當延長反應時間到20 min，但不得超過25 min，反之則減短反應時間。以50 μl/孔加入終止液終止反應。用酶標儀在雙波長450/630 nm處測定吸光度值(A值)，以標準品溶液的A值為縱坐標，以標準品相應的濃度為橫坐標制備標準曲線，求得參數擬合曲線方程。

采用連續3批EC原液對上述建立的方法進行專屬性、線性與范圍、準確性、重復性、中間精密度和耐用性等驗證。(1)專屬性實驗：分別應用EC原液的稀釋劑[磷酸鹽緩沖溶液(PBS)]和0.0 ng/ml的標準品，按照上述建立的方法進行檢測，比較兩者之間的A值。(2)線性與范圍實驗：取試劑盒中濃度為0.0 ng/ml、0.5 ng/ml、1.5 ng/ml、4.5 ng/ml、13.5 ng/ml、40.5 ng/ml的卡那霉素標準品進行試驗，所得數據進行回歸分析并計算擬合優度的判定系數R2。(3)準確性實驗(回收率)：取EC原液，首先將本品原液等體積加入13.5 ng/ml卡那霉素標準品，作為加入卡那霉素標準品的樣品，每個樣品重復測定2次A值；將A值的平均值代入標準曲線回歸方程求得卡那霉素濃度，計算回收率，回收率=(加入卡那霉素標準品(13.5 ng/ml)的EC原液樣品的卡那霉素濃度測定值×2-EC原液的卡那霉素濃度測定值)/加入卡那霉素標準品理論濃度值(13.5 ng/ml)×100%。(4)重復性實驗：取EC原液，按照上述建立的方法對每批原液重復測定6次，根據每批原液測得的A值進行數據分析。(5)中間精密度實驗：同一名實驗員不同時間，以及不同實驗員分別取EC原液按照上述建立的方法進行實驗，得到不同條件下EC原液中卡那霉素的濃度，對此數據進行分析。(6)耐用性實驗：取連續3批EC原液按照上述建立的方法進行實驗；在雙波長450/630 nm處測定A值時，連續檢測3次，每次間隔5 min，根據不同條件下標準曲線的擬合優度的判定系數R2及EC原液中卡那霉素的濃度進行數據分析。

2.致敏效應實驗：實驗組與對照組分別選用體質量300～400 g SPF級白色豚鼠各3只(雌雄不限)，實驗組每只豚鼠皮內注射0.1 ml 含5 μg 蛋白的EC原液稀釋溶液，共3次，每次間隔5 d。在第3次注射后15 d，實驗組與對照組每只豚鼠各皮內注射0.1 ml含5 μg 蛋白的EC原液稀釋溶液，連續觀察3 d，比較兩組動物全身反應及注射部位局部反應。

3.效價測定：選取2批次EC原液參考品(批號分別為M20101202和M20160301)，分別稀釋至1 μg/ml(5 U/ml)、2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml(50 U/ml)等4個稀釋度，根據劑量效應曲線確定合適的稀釋度建立效價測定的方法。建立的檢測方法為：取6只經TB-PPD皮膚試驗陰性的300～400 g SPF級雌性豚鼠，于每只豚鼠大腿腹股溝內側皮下注射結核分枝桿菌減毒株H37Ra活菌菌液0.5 ml，致敏5周后備用；將EC原液效力評價用參考品稀釋為2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml (50 U/ml)，將EC原液稀釋為2.5 μg/ml、5 μg/ml及10 μg/ml；取上述6只經結核分枝桿菌減毒株H37Ra活菌致敏5周后的豚鼠，去毛后每只豚鼠于背部脊柱兩側以輪圈法分別皮內注射上述3種稀釋度EC原液及參考品各0.2 ml，于注射后24 h測量局部反應硬結或紅暈的縱徑和橫徑(以硬結或紅暈反應大者為準)。統計6只豚鼠每個稀釋度注射后24 h硬結或紅暈平均直徑總和，并求每個稀釋度EC原液與相應稀釋度參考品的硬結或紅暈平均直徑總和的比值。

4.動物法鑒別實驗：取4只經TB-PPD皮膚試驗陰性的體質量300～400 g SPF級雌性豚鼠，于每只豚鼠大腿腹股溝內側皮下注射BCG菌液0.2 ml，致敏4周后備用；取上述致敏4周后的豚鼠背部脊柱兩側去毛，以輪圈法于豚鼠去毛部位皮內分別注射0.2 ml 20 μg/ml稀釋后的EC原液與50 IU/ml TB-PPD，于注射后48 h觀察并測量TB-PPD皮膚試驗的硬結平均直徑和EC原液的硬結或紅暈平均直徑(以硬結或紅暈反應大者為準)，根據48 h的反應結果進行判定。

5.其他檢測項目：EC原液外觀、蛋白質含量、純度(電泳法)、純度(高效液相色譜法)、分子量、等電點、紫外光譜、肽圖、N-端氨基酸序列、外源性DNA殘留量、宿主菌蛋白質殘留量、鑒別實驗(免疫印跡法)、細菌內毒素檢查、無菌檢查的質控方法和標準按照《中國藥典》2015年版(三部)內容建立。

(二)EC成品質量標準的建立

EC成品中“鑒別實驗”及“效價測定”方法及標準為本研究自建方法，其余檢測項依據《中國藥典》2015年版(三部)建立。

1.鑒別實驗：取4只經TB-PPD皮膚試驗陰性的體質量300～400 g SPF級雌性豚鼠，于每只豚鼠大腿腹股溝內側皮下注射BCG菌液0.2 ml，致敏4周后備用；取上述致敏4周后的豚鼠背部脊柱兩側去毛，以輪圈法于豚鼠去毛部位皮內分別注射0.2 ml EC成品與50 IU/ml TB-PPD，于注射后48 h 觀察并測量TB-PPD皮膚試驗的硬結平均直徑和EC成品的硬結或紅暈平均直徑(以硬結或紅暈反應大者為準)，根據48 h的反應結果進行判定。

2.效價測定：參照EC原液效價測定方法。

3.其他檢測項目：EC成品外觀、可見異物、裝量、滲透壓摩爾濃度、不溶性微粒檢查、pH值、苯酚含量、無菌、異常毒性檢查的質控方法和標準參照《中國藥典》2015年版(三部)建立。

(三)質量標準的驗證

應用建立的質量標準，對連續6批次EC原液和11批次EC成品進行檢測，驗證其適用性和可行性。

三、統計學處理

結 果

一、EC原液質量標準的建立和驗證

(一)殘余抗生素活性檢測

1.專屬性實驗：PBS溶液的A值為1.736，卡那霉素標準品(0.0 ng/ml)的A值為2.178。

2.線性與范圍實驗：卡那霉素標準品在0.5～40.5 ng/ml范圍內，連續3次實驗回歸方程擬合優度的判定系數R2均大于0.99。

3.準確性實驗：連續3批EC原液的卡那霉素殘留量回收率分別為112.163%、117.285%、103.527%，回收率均在80%～120%之間。

4．重復性實驗：連續3批EC原液分別測定6次，A值分別為1.754±0.098、1.783±0.164、1.781±0.144，重復性試驗A值相對標準偏差(RSD)分別為5.59%、9.18%、8.07%，RSD均小于20%。

5.中間精密度實驗：同一實驗員不同時間及不同實驗員檢測連續3批EC原液，卡那霉素殘留量均小于定量限0.5 ng/ml，為限量測定。

6.耐用性實驗：改變讀板時間(0、5、10 min)對EC原液卡那霉素殘留量檢測無影響，3批原液各個讀板時間檢測的卡那霉素殘留量均小于定量限0.5 ng/ml。

7.質量標準的驗證：連續6批次EC原液卡那霉素殘留量的檢測結果見表1，檢測結果均低于定量限0.5 ng/ml，為限量測定，表明該方法適合用于EC原液卡那霉素殘留量的測定。

表1 連續6批次EC原液殘余抗生素檢測結果

(二)致敏效應實驗

根據已建立的質量標準，對連續6批次EC原液進行致敏效應試驗，皮膚試驗后連續3 d實驗組及對照組動物注射部位局部反應無明顯區別，兩組動物也無全身反應。

(三)效價測定

1.質量標準的建立：2批次EC原液參考品的每個稀釋度皮膚試驗的硬結或紅暈平均直徑均≥8 mm，當稀釋度為2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml(50 U/ml)時，批次間差異無統計學意義；2個批次EC原液參考品每個稀釋度皮膚試驗的硬結或紅暈平均直徑總和比值均在1.0±0.2范圍之內，見表2。

表2 不同濃度各批次EC原液效價測定結果的比較

2.質量標準的驗證：對連續6批次EC原液效價進行測定，結果表明2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml (50 U/ml)每個稀釋度在注射后24 h所產生的局部反應硬結或紅暈的平均直徑均≥8 mm；每個稀釋度本品與相應稀釋度參考品的局部硬結或紅暈反應平均直徑總和的比值為0.9±0.1，均在1.0±0.2范圍內。

(四)動物法鑒別實驗

1.質量標準的建立：連續3個批次重組EC原液的動物實驗結果(硬結或紅暈平均直徑)為0，TB-PPD 硬結平均直徑為(15.13±5.06) mm。

2. 質量標準的驗證：連續6批次EC原液對BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗均呈陰性反應(硬結或紅暈平均直徑<5 mm)，而TB-PPD對BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗呈陽性反應(硬結平均直徑≥5 mm)。

(五)其他項目檢測

對連續6批次EC原液進行其他檢項的驗證，結果見表3。

表3 理化、生化、純度、安全等指標檢測EC原液的結果

二、EC成品質量標準的建立和驗證

1.質量標準建立：連續3批次EC成品的動物皮膚試驗結果(硬結或紅暈平均直徑)為0，TB-PPD硬結平均直徑為(16.50±2.65) mm。

2.質量標準的驗證：連續3種不同規格11批次EC成品對BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗均呈陰性反應(硬結或紅暈平均直徑<5 mm)，而TB-PPD 對BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗均呈陽性反應(硬結平均直徑≥5 mm)。

3.其他項目檢測：根據已建立的質量標準，對3種不同規格連續11批次EC成品進行其他項目的檢定，結果見表4。

表4 成品理化、生化、純度等指標檢測EC的結果

討 論

藥品的質量研究和質量標準的制定是藥物研發的主要內容之一。科學、合理、可行的質量標準直接關系到藥品質量的安全性、有效性和可控性[1]。確定質量研究內容時應根據產品的特性，采用多批次生產工藝穩定的樣品進行，使得質量研究的內容能夠充分反映藥品的特性及質量變化情況。

EC是一種新型皮膚試驗體內診斷試劑，屬于國家一類新藥，目前已獲得藥品注冊批件。在質量標準的制定過程中，由于尚無相應的檢定標準，本品質量標準的建立不僅參考了《中國藥典》2015年版(三部)、《生物制品質量控制分析方法驗證技術一般原則》等文件；而且，也結合了本產品的特性，從安全性、有效性等方面自建了部分檢測項目。由于本品在種子液的制備過程中加入了卡那霉素，故從安全性角度考慮，在EC原液檢測項中新建了“殘余抗生素活性測定”方法。EC為單一重組的相對分子質量為23 000的蛋白產品，并且屬于體內注射生物制品。根據該蛋白性質，理論上存在可能的致敏效應，可能會影響到受試者的生命健康。故從安全性角度考慮，在EC原液檢測項中新建了“致敏效應實驗”方法。本品的特性類似于結核菌素純蛋白衍生物等產品，是通過皮膚試驗的局部反應來進行結果判斷的，故從有效性方面考慮，在EC原液及成品檢測項中又新建了“效價測定”及“鑒別實驗”的方法。

在對本品自建的質量標準中，EC原液檢測項中“殘余抗生素活性測定”和“效價測定”則經過了相關方法學的驗證。其中，“殘余抗生素活性測定”方法，通過了專屬性、線性與范圍、準確性試驗、重復性、中間精密度和耐用性等驗證。專屬性驗證，結果表明EC原液的稀釋劑——PBS溶液不會影響到該方法測定的結果。線性與范圍驗證結果表明本法線性較好，EC原液卡那霉素殘留量在0.5～40.5 ng/ml范圍內可定量測定，即定量限為0.5 ng/ml；當卡那霉素殘留量低于0.5 ng/ml時應為限量測定，表示為小于0.5 ng/ml。準確性驗證結果表明本品對卡那霉素殘留量的檢測沒有影響。重復性驗證結果表明重復性良好。中間精密度驗證結果表明同一實驗員不同時間和不同實驗員檢測連續3批次樣品卡那霉素殘留量均低于定量限0.5 ng/ml，實驗的中間精密度良好。耐用性驗證結果表明改變讀板時間對重組EC原液卡那霉素殘留量檢測無影響，耐用性良好。綜上，通過卡那霉素殘留量測定方法的驗證，表明該方法適合用于EC原液殘余抗生素活性的測定。另外，EC皮膚試驗可誘導結核分枝桿菌感染者產生局部特異性紅暈或硬結反應，陽性者中存在紅暈大于硬結或硬結大于紅暈現象，不能單獨以紅暈或者單獨以硬結作為陽性判定標準。因此，EC宜以注射部位的紅暈或硬結反應大者為陽性反應判斷標準。在本研究中，筆者選取2批次EC原液參考品的4個稀釋度進行了效價測定方法的建立。結果表明，每個稀釋度在皮內注射后24 h所產生的局部硬結或紅暈平均直徑均≥8 mm，且2批次EC原液參考品的每個稀釋度在注射后24 h所產生的硬結或紅暈平均直徑總和的比值均在1.0±0.2范圍內；但稀釋度為1 μg/ml(5 U/ml)時，兩批次EC原液參考品在注射后24 h所產生的硬結或紅暈平均直徑的差異有統計學意義，考慮實驗結果的敏感度最終選擇EC原液效價測定的稀釋度為2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml (50 U/ml)等3個稀釋度。

EC是由高效表達結核分枝桿菌ESAT-6與CFP-10基因的大腸埃希菌，經發酵、分離和純化后獲得的。由于BCG不含有ESAT-6和CFP-10這2個基因片段，而皮膚試驗用試劑TB-PPD又存在于BCG及結核分枝桿菌中，因此，EC原液及成品的“鑒別實驗”均選取BCG活菌進行動物的致敏，并最終通過TB-PPD的皮膚試驗反應進行鑒別。在此方法的建立過程中，筆者選取連續3個批次EC原液及連續3個批次的EC成品進行動物實驗，結果表明EC原液及成品對BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗均呈陰性反應，而TB-PPD對BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗均呈陽性反應。EC成品的“效價測定”方法是參照EC原液“效價測定”方法建立的，由于EC原液“效價測定”選取了2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml (50 U/ml)3個稀釋度；而EC成品的濃度為10 μg/ml (50 U/ml)，故該濃度適合成品的“效價測定”。

為了驗證已建立的質量標準檢測方法科學、合理及可行性，筆者依據已建立的方法，又進行了連續6批次EC原液和3種不同規格連續11批次成品的檢定，所有檢測結果均符合制定的質量標準，表明建立的質量標準適用于該產品的檢定。