鄭州市新生兒非衍生化法氨基酸和酰基肉堿參考區間的制定

王雪俠，黨晨瀅

(鄭州市婦幼保健院 檢驗科，河南 鄭州 453001)

新生兒遺傳代謝病一般是由遺傳物質或者致病基因發生改變引起的，這類疾病通常具有先天性、終身性和家族性的特點，且種類繁多，臨床表現復雜多樣，發病輕重不一，無特異性[1]。雖然單一病種發病率較低，但是總體發病率較高，有報道新生兒遺傳代謝病的患病率在千分之五以上。部分遺傳代謝病患兒若未得到及時有效的診治，常可致殘，嚴重者危及生命。遺傳代謝病的確診和分型常需要根據實驗室結果來進行，這些檢查包括特異的代謝物測定、酶活性測定、生化指標測定和基因突變檢測。遺傳代謝病通過早期檢測、干預可以避免或減少嚴重并發癥及神經系統的損害，串聯質譜法可以同時進行幾十種氨基酸和肉堿的檢測。有研究表明串聯質譜法在新生兒期進行檢測，對遺傳代謝病的早期診斷和預防有著舉足輕重的作用[2]。本研究的目的在于探討制定符合鄭州市新生兒人群的氨基酸和酰基肉堿參考區間，以使篩查更科學合理。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2016年8月至2019年9月在鄭州市行政區域內出生的新生兒[3]，其監護人自愿參加新生兒遺傳代謝病檢測且簽署新生兒遺傳代謝病篩查知情同意書。各助產機構采血人員嚴格按照《新生兒遺傳代謝病篩查血片采集技術規范》采集足跟血，采血時間要求為出生72 h后，7 d內，并充分哺乳8次以上，對于各種原因延遲采血者，采血時間不超過出生后20 d[4]。足跟血制成干血斑，在規定時間內冷鏈遞送至實驗室，不符合要求的血片予以退回，合格血片收入實驗室。本研究的檢測項目包括11種氨基酸、31種肉堿，數據均來自日常工作，符合相關規定。本研究無任何利益沖突。

1.2 儀器與試劑廣州市豐華生物工程有限公司FH6000MD三重四級桿串聯質譜分析系統，豐華DBS220X全自動打孔儀，豐華恒溫微量振蕩器，超聲波清洗儀，豐華非衍生化多種氨基酸、酰基肉堿測定試劑盒[5]。

1.3 檢測方法

1.3.1標本采集 所有標本均制成血斑，室溫下晾干(4～6 h)。

1.3.2樣品處理 使用自動打孔器將質控和標本打孔，直徑約為3.0 mm，依次放入U型底微孔板中，每孔加入已配制好的萃取液100 μL，封板，在30 ℃，700 r·min-1的條件下振蕩45 min，然后靜置5 min，揭去封板膜，每孔轉移65 μL至對應位置的V型板內，用鋁箔封板覆蓋，上機[6]。采用全掃描采集模式，通過IRC-Pro軟件計算各分析物濃度，整理成Excel表格供分析。

2 結果

2.1 正態性檢驗經單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗判斷資料的正態性，結果顯示11種氨基酸和31種肉堿為非正態分布[7]。

2.2 鄭州市新生兒11種氨基酸和31種肉堿的參考范圍本次研究數據為非正態分布，為了兼顧假陽性和假陰性，選取雙側95%人群所在范圍作為正常參考范圍，以百分位數(P2.5，P97.5)表示，統計出鄭州市61 199個新生兒非衍生法遺傳代謝病篩查串聯質譜指標中氨基酸和酰基肉堿(表1)的醫學參考范圍[8]。

表1 非衍生化法氨基酸和酰基肉堿的參考范圍(μmol·L-1)

續表1

3 討論

新生兒遺傳代謝病的篩查在中國已有數年歷史，我國最早是從20世紀80年代開始，首先開展的醫院有上海市兒科研究所、上海交通大學醫學院附屬新華醫院，歷年的群體篩查證明，新生兒遺傳代謝病的篩查是一種行之有效的方法[9]。新生兒遺傳代謝病在群體篩查的三級預防中目標明確，防治效果較好，可評估，獲益較大。傳統的新生兒遺傳代謝病篩查每個項目都需要各自打取血斑，分開實驗，而串聯質譜篩查新生兒遺傳代謝病則具有快速、簡便、標本用量少(1個血斑)、檢測病種多等優點。此外，非衍生化方法檢測多種氨基酸、酰基肉堿時不易對環境和工作人員造成污染。2002年自串聯質譜應用于新生兒遺傳代謝病篩查以來，我國新生兒遺傳代謝病篩查工作取得了舉世矚目的成績，但是也伴隨著一些問題，例如篩查項目不統一，各地參考范圍不同等。參考范圍不同會導致結果在判讀方面出現差異。

通過查閱文獻，本研究結果和國內其他篩查中心的參考范圍有差異，考慮存在地區和環境因素，各實驗室根據本地區情況制定相應的參考范圍，才能夠更好地篩查出高危可疑患兒。歷年的篩查經驗表明，制定科學合理的參考范圍才能使指標更適用于臨床。從全國的統計來看，新生兒遺傳代謝病篩查普遍存在假陽性率偏高的情況。本研究選取2016年8月至2019年9月在鄭州出生的61 199例新生兒作為觀察對象，通過軟件測算出11種氨基酸和31種肉堿的參考范圍。另外，還根據《新生兒疾病串聯質譜篩查技術專家共識》[10]計算了一些氨基酸和酰基肉堿的比值指標，例如常用的Arg/Orn、Arg/Phe、Phe/Tyr、C3/C2、C4/C2等37項比值，這些比值指標可以用于疾病的判斷和分型。后期結合基因診斷和其他確診實驗結果再定期進行評估，以便于評價所有這些指標的適宜性。新生兒遺傳代謝病篩查假陽性率較高，合理制定醫學參考范圍，可減少假陽性新生兒的出現，從而穩定家庭情緒，減少經濟負擔。遺傳代謝病臨床表現形式多樣，發病年齡不定，多數表現不典型，缺乏特異性，全身各個器官均可受累[11]，以神經系統和消化系統的表現較為突出，其余臨床表現還有急性代謝性腦病、高氨血癥、代謝性酸中毒等，對于不能用一般疾病解釋的臨床表現，應高度懷疑為遺傳代謝病。制定合理的參考范圍，對遺傳代謝病的篩查和診斷有著非常重要的作用，可更好地提高出生人口素質，輔助臨床診治。