兩株紅樹林來源鏈霉菌的鑒定和抗菌活性研究

葉景靜，盧覃培，賈舒涵，鄭紅蕓，孫承航，黃大林

(1.桂林醫學院基礎醫學院微生物實驗室，廣西 桂林 541004；2.中國醫學科學院&北京協和醫學院醫藥生物技術研究所微生物化學研究室，北京 100050)

由于耐藥菌的日益泛濫，以腸球菌(Enterococcus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、克雷伯菌屬(Klebsiellaspp.)、不動桿菌屬(Acinetobacterspp.)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和產超廣譜β-內酰胺酶的腸桿菌科細菌(ESBL-producingEnterobacteriaceae)為主要的 ESKAPE[1]耐藥問題現今給臨床上的治療已經帶來了極大困難，所以新型抗生素的研發已經是一個急需解決的問題。

放線菌是我們從自然界里發現抗生素的重要來源之一[2]。人們從微生物次級代謝產物中發現了一大批具有不同化學結構和生物活性的抗生素，如氯霉素、紅霉素、利福霉素、慶大霉素和雷帕霉素等。據報道，現有抗生素約三分之二是由放線菌產生的[3]。然而，從普通環境中獲得新的微生物天然活性產物越來越困難[4]。因此，人們開始將研究的目光投向特殊環境微生物，如海洋、洞穴、熱泉和沙漠等，以期得到新的微生物種類，進而獲得新的抗生素或其他生物活性物質[5]。

紅樹林因為受到潮水周期性的浸沒，具有水分高、耐缺氧、鹽分高等特點，是生長在熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的特殊生態系統，是一種獨特的植物群落，該地區有著十分豐富新穎的放線菌微生物資源[6]。本次實驗地點選擇了污染少、物種豐富和研究相對較少的廣西茅尾海紅樹林[7]，發現2株活性較強的鏈霉菌，從生物學特征，抗菌活性和系統發育樹進行研究，這為發現新抗生素提供了微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品 2株從廣西茅尾海紅樹林根際土壤獲得的鏈霉菌。

1.1.2培養基 ①分離用培養基：M1(高氏一號培養基)：海晶鹽3 g，可溶性淀粉20 g，MgSO40.5 g，K2HPO40.5 g，KNO31 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，pH 7.2；M2(高氏二號培養基)：胰蛋白胨3 g，葡萄糖10 g，氯化鈉5 g，蛋白胨5 g，復合維生素1 mL，瓊脂18～20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2；M3(海藻糖-脯氨酸培養基)：脯氨酸1 g，海藻糖5 g，(NH4)2SO41 g，NaCl 1 g,K2HPO41 g,MgSO4·7H2O 1 g,CaCl22 g,復合維生素1 mL，瓊脂18～20 g，pH 7.2；M4(棉子糖-組氨酸培養基)：L-組氨酸1 g，棉子糖5 g，KNO31 g，K2HPO41 g，NaCl 1 g，CaCl22 g，MgSO4·7H2O 1 g，瓊脂20 g，pH 7.3～7.4。② 純化選用培養基:改良ISP2 固體培養基。③發酵選用培養基:改良 ISP2 液體培養基。④檢定菌株選用培養基:Mueller-Hinton( M-H) 培養基(英國OXOID)。

1.1.3抑制劑 重鉻酸鉀 25.0 mg·L-1，放線菌酮 50.0 mg·L-1，萘啶酮酸 25.0 mg·L-1。

1.1.4檢定菌株 鮑曼不動桿菌敏感株ATCC19606和耐藥株2799、金黃色葡萄球菌敏感株ATCC29213和耐藥株ATCC43300、大腸埃希菌敏感株ATCC25922和耐藥株2800、銅綠假單胞菌敏感株ATCC27853和耐藥株2774、糞腸球菌敏感株ATCC33186和耐藥株VRE310681、肺炎克雷伯菌敏感株ATCC10031和耐藥株ATCC700603，都由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所提供。

1.1.5試劑與儀器 硅膠板silica gel 60 F254 20180204，德國Merck公司；Chelex100 樹脂 20180911，美國 BioRad公司；重鉻酸鉀 20180328，Sigma 公司；引物( 27F，1492R) 20180312、萘啶酮酸20171123、GelGreen染料20170927、DNA Marker 20180907，上海生工生物工程股份有限公司；放線菌酮20171207、2×Easy Taq SuperMix 20180907，北京全式金公司；乙酸乙酯(分析純) 20180726，二氯甲烷(分析純) 20190408，甲醇(分析純) 20180906，丙酮(分析純) 20180918，北京化工廠。

微量移液器 Eppendorf，Germany,旋轉蒸發儀OSB-2100，日本EYELA公司；電泳儀，北京市六一儀器廠；離心濃縮機 Christ，德國；凝膠成像儀，美國 Bio-Rad 公司；快速多任務 PCR 儀，Gene Company；WZT-1M 細菌比濁儀，上海勁佳;旋轉式搖床，全恒溫培養箱、上海智城分析儀器制造公司；雙人單面潔凈工作臺，新加坡ESCO；半自動TLC點板儀、全自動展開缸 瑞士CAMAG 公司；臺式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠。

1.2 方法

1.2.1處理樣品 參考吳越等[8]的樣品處理方法，將采集的新鮮潮濕樣品置于無菌平皿中，在通風的空間室，溫條件下自然風干，并罩上紗布以防蚊蟲掉落，等樣品完全干燥后，再用無菌研缽將土壤研磨成細沙狀。分別稱取5 g不同土壤，倒于45 mL裝有無菌玻璃珠和無菌水的小錐形瓶中溶解，放在180 r·min-1、28 ℃ 的搖床里振蕩3 h；再吸取1 mL 土壤懸濁液于9 mL無菌水中，依次稀釋濃度為 10、1、0.1 g·L-1，接著分別吸取0.2 mL稀釋液涂布于4種不同分離培養基上，將分離平板用寬度適中的封口膜封口，避免培養過程中水分的蒸發和雜菌的污染。放入 28 ℃培養箱中，恒溫培養 4 周以上，隨時進行形態觀察。

1.2.2菌種的分離、純化與保藏 培養2 ～8周，定期觀察平皿生長情況，若有霉菌生長，及時將燃燒酒精棉花覆蓋在上，如有菌落生長，首先進行初步排重，再挑取單菌落在培養基上，進行四區劃線純化，以獲取純培養物。將新鮮菌體，盡量多的，存入20%無菌脫脂牛奶中，真空冷凍干燥后，保藏于4 ℃冰箱。同時，存入20%甘油管，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.316S rRNA基因序列的擴增及測序和構建系統進化樹分析 ① 參考Chelex-100 法提取放線菌基因組DNA[9]。選用擴增引物為通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R ( 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應體系為50 μL如下:2 × Easy Taq Supermix 25 μL，27F(10 μmol·L-1) 1.5 μL，模板 2 μL，1492R( 10 μmol·L-1) 1.5 μL，無菌水20 μL。PCR反應條件如下:預變性95 ℃ 5 min;變性 94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，延 伸72 ℃ 2 min，35 個循環；后延伸 72 ℃ 10 min。② PCR產物采用 1% 瓊脂糖凝膠 電壓110 V、時間30 min 電泳檢測，凝膠成像儀觀察電泳結果；獲得的陽性結果交由生工生物工程(上海) 股份有限公司測序。③ 將獲得的序列利用EzT-axon-e 工具[10]和 BLAST 程序進行相似性比對。從中選擇相似性較高且是有效描述的典型菌株的 16S rRNA 基因序列作為參比對象，采用Clustal W進行多序列比對[11]，采用MEGA 7.0 軟件[12]通過鄰接法( Neighbor-Joining) 進行聚類分析，和構建系統發育樹[13]，根據 Kimura two parameter[14]模型估計系統進化矩陣，重復取樣 1 000次進行自展值( Bootstrap value) 分析，來評估系統進化樹拓撲結構的穩定性。

1.2.4抗菌活性篩選

1.2.4.1樣品的制備 將純化的菌株，裝于有 100 mL 液體發酵培養基的500 mL錐形瓶中，分別接種3瓶，搖床轉速為180 r·min-1，溫度 28 ℃ 培養1周左右。將培養好的發酵液4000 r·min-1離心 30 min，將獲得上清液用等體積的乙酸乙酯分多次萃取，濃縮干燥后，用 3 mL的甲醇溶解酯相。萃取后的水相60 mL，揮發干燥，丙酮浸泡菌體靜置24 h，兩者都用 3 mL 1 ∶1甲醇水溶液溶解。

1.2.4.2檢定菌株的制備 將檢定菌株分別接種于裝有10 mL MH液體培養基的 50 mL 試管中，搖床設置 37 ℃、180 r·min-1培養 12～24 h，再將菌懸液調為0.5 麥氏濃度單位按 8%～1% 濃度加入到溫度降至55 ℃左右的培養基中，倒之前先搖晃混勻，每皿倒入培養基15～20 mL ，置 4 ℃冰箱備用。

1.2.4.3抗菌活性篩選 篩選方法采取紙片擴散法(K-B法)，在無菌圓形濾紙片(d=6 mm)上，分3次加入共60 μL 已制備完成的3類樣品(水相、酯相、菌體)，揮發干燥后，貼在含有檢定菌的培養皿上，將平皿放在37 ℃培養箱，12～24 h 后，測量抑菌圈的大小。

1.2.5活性物質的TLC分析

1.2.5.1TLC展開條件的選擇 ①點樣：將 TLC 鋁箔板切成 1 cm×10 cm 長條狀，距下邊緣 1 cm 處點樣，至鋁箔板吸附達到飽和為止②分析：選擇二氯甲烷：甲醇體積比分別為 49 ∶1，19 ∶1，9 ∶1 的展開劑，在展開缸中預飽和 15 min，然后垂直放入已經點樣的 TLC 鋁箔條。③ 測活：待TLC鋁箔板上的溶劑揮發干后，在紫外燈 (254 nm) 下標記各點位置，將它們分別貼于 MRSA 檢定板上，37 ℃下培養 16 h 后，觀察抑菌圈的位置，并計算出 Rf值，確定活性點的位置。

1.2.5.2 TLC板制備活性物質 粗提物用少量甲醇溶解后，用 CAMAG LINOMAT5 半自動點樣儀點樣于硅膠 20 cm×10 cm 硅膠板 (silica gel 60 F254,Merck) 上，以二氯甲烷 ∶甲醇=9 ∶1 (V/V) 為展開劑，上行展開分離，待溶劑揮干后，在紫外燈 (254 nm) 下標出條帶，并按展開方向為條帶編號。將條帶分別刮下，根據條帶的 Rf值選擇適當極性的洗脫劑將活性成份充分洗下，收集洗脫液并濃縮備用。

2 結果

2.1 抗菌活性采用標準菌株進行抗菌活性試驗，結果顯示菌株B353和B486對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有較好的活性( Tab 1)，菌株B486對金黃色葡萄球菌有較好的抗菌活性，其中敏感株抑菌活性弱于耐藥株，菌株B353對糞腸球菌和金黃色葡萄球菌均表現出較強抑菌活性，其中對金黃色葡萄球菌的抗菌活性較強(Fig 1)。

Tab 1 Results of antimicrobial activity screening of culturable strains B353 and B486(mm)

Fig 1 Partial antimicrobial activity of culturable strains B353 and B486A:Antibacterial activities of Enterococcus faecalis sensitive strain;B:Antibacterial activities of Staphylococcus aureus resistant strain;a:B353;b:B486.

2.2 菌落特征在改良的 ISP2 培養基上，菌株B353和 B486 生長狀態良好，菌落緊貼于培養基表面生長，多皺褶，干燥，典型的放線菌形態。菌株B353菌落起先白色，逐漸生長轉為灰白色，質地疏松，布滿孢子絲，易被挑取。B486表面干燥，有褶皺，質地較密，菌落為白色，當孢子絲產生大量孢子并布滿菌落表面形成顆粒狀，生長周期較長，不易挑起(Fig 2)。

Fig 2 Colony morphology of two strains of Streptomyces under macroscopic stereomicroscope and on culture medium

2.3 基于16S rRNA構建2株放線菌的系統發育樹菌株B353和菌株B486分別測通獲得菌株的16S rRNA 基因序列(1 364 bp和1 375 bp)，將序列提交 GenBank，登錄號分別為MN199494和MN199470。登錄 EzTaxon，比對結果發現菌株B353和菌株B486與StreptomycesseoulensisNRRL B-24310T的相似率都為99.93%，且菌株B353和菌株B486在 N-J 樹上形成一簇再與之為一簇，菌株B353和菌株B486 初步鑒定是鏈霉菌屬StreptomycesseoulensisNRRL B-24310T的兩個變種( Fig 3) 。

Fig 3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of B353 and B486

2.4 活性物質TLC 分析結果菌株B353發酵液粗提物在二氯甲烷 ∶甲醇=9 ∶1 的條件下有較好的展開效果，在Rf值0.8的位置顯示出了抑菌活性，確定二氯甲烷 ∶甲醇=9 ∶1 為最佳展開條件，TLC 板上 9～10、10 和 10～11 號條帶有抗金葡菌活性，且 10號帶活性最強，而其他條帶無活性。菌株 B486發酵液粗提物在二氯甲烷 ∶甲醇=9 ∶1 的條件下有較好的展開效果，在Rf值0.7的位置顯示出了抑菌活性，確定二氯甲烷 ∶甲醇=9 ∶1 為最佳展開條件，TLC 板上 11、12 和 12～13號條帶有抗金葡菌活性，且 12號帶活性最強，而其他條帶無活性( Fig 4)。菌株B353和菌株B486洗脫過濾后得到活性物質。

Fig 4 TLC profile of EA extract of strain B353 and strain B486 and anti-MRSA results of each bandA:TLC profile of EA extract sample of strain B353 cultural broth at UV 254 nm,band 9～10,10 and 10～11 (red);B:The anti-MRSA results of the bands from TLC,band 9～10,10 and 10～11 showed inhibition zone;C:TLC profile of EA extract sample of strain B486 cultural broth at UV 254 nm,band 11,12 and 12～13 (red);D:The anti-MRSA results of the bands from TLC,band 11,12 and 12～13 showed inhibition zone.

3 討論

生長在紅樹林這種極端環境的放線菌有著不同于陸地微生物的代謝途徑，因此其次級代謝產物在類型、生物活性和結構等方面都表現出與普通環境放線菌有著不同的特點[15]。據文獻報道，紅樹林土壤中分離出的放線菌遠多于植物內生分離出的放線菌[16]，其中鏈霉菌屬是紅樹林土壤放線菌中的優勢菌屬。Zhang 等[17]在 1 株鏈霉菌中分離得到了 2 個對大腸桿菌有著較好的抗菌活性的新化合物。許琳雅等[18]從StreptomycesNo.H74-18 菌株中發現新化合物 antimycin A18 及 A19和分離得到抗霉素類化合物。這些研究表明，紅樹林中的鏈霉菌有著巨大的開發潛能和研究價值。

廣西茅尾海紅樹林是我國特有的巖灘紅樹林，有著豐富和新穎的土壤微生物。本實驗研究廣西茅尾海來源的兩株鏈霉菌的生物特征和抗菌活性。兩株菌B353和B486在測序比對后，通過構建進化樹和表征的顯微鏡觀察，初步鑒定為鏈霉菌屬的兩個變種。菌株B353和菌株B486對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有較好的活性，說明兩株菌的抗菌能力較為廣譜。其中菌株B353的抗菌活性明顯強于菌株B486，兩份活性物質對金黃色葡萄球菌的抗菌能力也是各有區別。這為我們篩選新型抗生素打下了一定的物質基礎。

大量的研究結果表明，紅樹林有著豐富的鏈霉菌其生物活性代謝物質依然有著研究潛力。本次實驗結果表明廣西紅樹林中放線菌資源豐富，其中鏈霉菌屬對金黃色葡萄球菌良好的抗菌活性，這為活性次級代謝產物的篩選和新型抗生素的開發奠定了基礎。