基于網絡藥理學的山豆根神經毒性機制探討

劉 暢，俸婷婷，劉雄偉，石 慧，沈奇濤，周 英

(貴州中醫藥大學 1.藥學院、2.藥食兩用資源應用與開發研究中心，貴州 貴陽 550025)

山豆根為豆科植物越南槐(SophoratonkinensisGagnep.)的干燥根及根莖，味苦，性寒有毒，具有清火、解毒、消腫、止痛的功效。山豆根具有抗炎、抗心律失常、抗潰瘍保肝等藥理作用，同時也可引起嚴重的毒副反應，如神經毒性、肝毒性、心血管毒性及引起胃腸道反應、過敏反應等，以神經毒性最為典型[1]。神經毒性反應的臨床表現稱為山豆根中毒性腦病(radixsophoraetonkinensistoxic encephalopathy)[2]，其臨床表現為頭昏、眼花、疲乏無力、嗜睡等，嚴重者則大汗淋漓、視覺障礙、意識模糊，全身肌肉顫動、抽搐、驚厥、昏迷，最終中樞性呼吸衰竭而死亡。山豆根主要含黃酮、生物堿及多糖類成分，如金雀異黃素、槐酮、槐定、苦參堿、氧化苦參堿、臭豆堿、金雀花堿、N-甲基金雀花堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐氨、槐醇等[3]。苦參堿、氧化苦參堿為主要的生物堿成分，既是藥效物質基礎，也是毒性物質基礎[1]，而金雀花堿含量太低難以引起毒性反應[4]。

山豆根中生物堿是引起毒性反應的物質基礎，超劑量服用是中毒的主要原因，據報道用量3～5 g未發生中毒事件，6～9 g發生中毒反應的報道為4.7%，12～15 g發生中毒反應的報道為17.6%[3]。研究表明，過量服用山豆根后，苦參堿、氧化苦參堿等生物堿成分可抑制體內乙酰膽堿酯酶(acetylcholin esterase，AChE)活性，誘發惡心、嘔吐、頭暈、出汗、吞咽困難、構音障礙，以及腹瀉、肌肉痙攣、全身抽搐等乙酰膽堿樣臨床癥狀[1]。山豆根能夠導致神經中毒，但山豆根中有效成分的毒性作用分子機制，其有效成分占比與其所發揮的活性是否成比例，目前尚不清楚。

中藥具有多成分、多靶點、多通路的特點，藥物分子作用于單一靶點或信號通路的研究難以揭示其科學內涵。網絡藥理學從相互關聯的角度研究問題，從整體水平上研究藥物的作用機制，為中藥復雜作用規律提供新的思路[5]。從系統、整體的角度將藥物和疾病關聯起來，從多個角度將藥物成分靶點網絡與生物靶點網絡相結合，更加系統全面地研究藥物的作用機制。因此，本研究應用網絡藥理學的思路構建山豆根“活性成分-靶點-通路”的相互作用網絡關系，探討山豆根神經毒性潛在作用的分子機制。

1 方法

1.1 山豆根成分收集與篩選以“山豆根”為關鍵詞在傳統中藥系統藥理學數據庫和分析平臺TCMSP(http://tcmspw.comltcmsp.php)中查找山豆根所含活性成分。在PubChem數據庫中下載其活性成分Smiles化學式。利用相對分子質量(MW)≤500，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18 篩選山豆根的活性成分。OB 值是評價藥物能否發揮藥效的重要指標，DL 值代表成分與已知藥物的相似性，OB 值越高通常表示藥物的生物活性分子的DL值越好，對確定中藥成分是否對機體產生活性具有重要參考價值。CTD 數據庫(http://ctdbase.org/)提供多種毒理學信息，將TCMSP 數據庫中篩選出的化合物輸入CTD 數據庫中進行毒性查詢，得到山豆根中有毒的化合物成分。

1.2 作用靶點的篩選

1.2.1山豆根活性成分作用靶標預測 Swiss Target Prediction(http://www.swiss target prediction.ch/) 能夠精確預測生物活性分子靶點的服務器，根據化學成分的2D和3D結構，基于Daylight FP2 的分子指紋方法，并采用Tanimoto系數定義的相似度度量方法進行預測。利用PubChem(https://pubchem.Ncbi.nlm.nih.gov/) 數據庫，將所有的化合物轉化為標準的Canonical SMILES 格式，將Canonical SMILES格式文件導入Swiss Target Prediction平臺，將其屬性設置為“homo sapiens”，預測活性化合物的潛在靶點，利用UniProt 數據庫將這些靶蛋白轉換成對應的基因名稱。

1.2.2神經相關靶點的收集 通過GeneCards(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)，以“toxic encephalopathy”或“nerve toxicity”為關鍵詞檢索與神經毒性相關的基因，篩選并刪除重復靶點基因，與山豆根作用的靶標基于進行交集比對，最終獲得山豆根有毒化合物的神經毒性潛在靶點。

1.3 網絡構建

1.3.1核心靶點之間的蛋白與蛋白相互作用(PPI)網絡圖 為了分析山豆根神經毒性靶點間的相互作用，將山豆根神經毒性潛在靶點導入String 數據庫，獲得靶點間相互作用關系，保存為TSV格式，把其中條目node1和node2數據導入Cytoscape 3.7.1軟件，計算Degree值，將靶點大小和顏色設置用于反映節點數的大小，顏色的深淺設置用于反應結合分數的大小，從而獲得最終的蛋白互作網絡。

由于廣義互相關算法(GCC-PHAT)[8]所需的數據量少且具有較好的抗混響能力,是目前基于到達時間差定位方法中使用較多的一種算法。信號x1和x2的廣義互相關函數的計算如式(1)所示:

1.3.2“化合物-靶點”網絡圖 將候選化合物與山豆根神經毒性潛在靶點導入Cytoscape 3.7.1 軟件，建立山豆根毒性成分-靶點網絡，預測出山豆根引起神經毒性反應的化合物與靶點網絡關系圖。化合物節點數(degree) 表示化合物對應的預測神經毒性靶點的個數，度值較大的化合物進行重點分析，靶點的節點數(degree) 的度值越大，則這個靶點越有可能是化合物的關鍵作用靶點。

1.4 靶點通路注釋分析GO(gene ontology)分析廣泛應用于基因功能分類，主要用來描述基因的分子功能、生物學過程和細胞組分。利用DAVID工具(https://david.ncifcrf.gov/)進行對山豆根-中樞神經系統受損交集蛋白靶標基因GO生物學過程富集分析(P<0.05)。應用 KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)工具對山豆根-中樞神經系統受損交集蛋白靶標基因進行KEGG通路富集分析(P<0.05)，篩選山豆根神經毒性潛在靶點基因可能具有的生物學功能及參與的生物學通路。最后，將分析得到的靶點通路與山豆根成分相對應，利用Cytoscape3.7.1 軟件進行網絡構建，形成毒性成分-靶點-通路網絡。

2 結果

2.1 山豆根活性成分的篩選利用TCMSP 數據庫收集到79個山豆根主要化學成分。篩選過程中發現部分成分未能滿足OB≥30%和DL≥0.18，但在山豆根中含量較高且有大量文獻證明其與中樞神經系統損害有關，所以也將其納入活性成分進行研究，篩選主要的化學成分21個。將21個主要化學成分輸入比較毒物基因組學數據庫(CTD)數據庫，查找其毒理學作用，獲取15種山豆根毒性相關信息(Tab 1)。

Tab 1 The toxicity compound of Sophora tonkinensis Gagnep

2.2 候選化合物神經毒性靶點預測及篩選Swiss target prediction數據庫檢索15種山豆根候選毒性成分對應的靶蛋白，合并以后去除重復的，整理得到14種化合物對應靶點共343個(未查詢到臭豆堿對應的靶點)，利用UniProt 數據庫將靶蛋白轉換成對應的基因名稱。在GeneCards數據庫檢索與神經毒性相關的基因，其中以“toxic encephalopathy”為關鍵詞檢索到226個基因，以“nerve toxicity”為關鍵詞檢索到到475個基因，合并去重復靶點后共得到554個基因。將此網絡與山豆根候選毒性成分對應靶點功能相映射，篩選得到89個山豆根神經毒性潛在的靶點。

2.3 靶點PPI網絡作圖將篩選出的山豆根神經毒性潛在靶點導入String 數據庫中，獲得蛋白相互作用關系，將其保存為TSV.文件，導入Cytoscape中構建蛋白互作網絡。核心靶點蛋白互作(protein protein interaction，PPI)網絡圖(Fig 1)。其中顏色深淺反映該靶點連接其他靶點個數的多少，用連接度Degree 體現，顏色的深淺反映Degree程度。Degree 值越高，顏色越深(黃色)表明該靶點的作用越關鍵(Fig 1)，連接度較高的核心靶點有AKT1(degree=58)、MAPK3(degree=52)、MAPK1(degree=45)、EGFR(degree=42)、SRC(degree=42)、HSP90AA1(degree=39)、APP(degree=37)、JUN(degree=37)、PTGS2(degree=37)等，靶點兩兩間的互作作用程度各不相同。

Fig 1 Nerve toxicity target interaction network of Sophora tonkinensis Gagnep

2.4 候選化合物-靶點網絡分析化合物-核心靶點網絡描述山豆根中候選毒性成分作用于上述89個靶點的網絡(Fig 2)。每種化合物作用于多個靶點，每個靶點也可由多個化合物產生作用，但BCL2、BCL2L1、CDK4、ERBB2、GRM1、GSTM1、HDAC4、LRRK2、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MAPK8、MAPK9、MDM2、NR3C1、REN、RET、SORD等僅有醉茄素(withaferine)作用。從蛋白靶點角度來看，較為重要的蛋白靶點ACHE、CHRNA3、CHRNA4、MAOA、PARP1、PTGS1、PTGS2、TYR、XDH等，其中PARP1與10種化合物存在互相關系，CHRNA4與8種化合物存在互相關系，ACHE與8種化合物存在互相關系。從化合物角度來看，槲皮苷(quercetin)、黃羽扇豆魏特酮(lupiwighteone)、金雀異黃酮(genistein)、苦參堿(matrine)、山柰酚(kaempferol)、醉茄素(withaferine)等，其中槲皮素(quercetin)與36個靶點存在相互關系。

Fig 2 A network of toxic compounds-nerve target of Sophora tonkinensis Gagnepred arrow node Represents active component,cyan node represents target.

Fig 3 Nerve toxicity target GO enrichment analysis in Sophora tonkinensis Gagnep

利用Kobas3.0在線軟件進行KEGG 生物通路分析。KEGG結果表明，89個靶點主要富集在160個信號通路(P<0.05)，主要涉及PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、粘合斑(focal adhesion)、含血清素的神經突觸(serotonergic synapse)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、神經活性配體與受體相關作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、間隙連接(gap junction)、鞘脂類信號通路(sphingolipid signaling pathway)、神經營養因子信號通路(neurotrophin signaling pathway)、多巴胺能神經突觸(dopaminergic synapse)、膽堿能突觸(cholinergic synapse)、MAPK 信號通路(MAPK signaling pathway)、鈣信號通路(calcium signaling pathway)、細胞凋亡(apoptosis)、T細胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、細胞血管內皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)等(Tab 2)。

Tab 2 Nerve toxicity target KEGG pathway analysis in Sophora tonkinensis Gagnep

2.6 山豆根有毒活性成分-靶點-通路網絡模型將富集分析得到的20個主要通路對應山豆根有毒活性成分及靶點，構建“有毒成分-靶點-通路”網絡模型。此網絡黃色節點代表山豆根中的活性成分，青色節點代表潛在靶點，紫色箭頭節點代表調控通路，邊代表三者之間的相互作用(Fig 4)。從富集通路的多少來看，較為重要的蛋白靶點AKT1、BCL2、EGFR、GSK3B、JUN、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MAPK8、MAPK9、PIK3CG、PRKCA、RAF1和SRC等，其中MAPK1和MAPK3均富集到17個通路，AKT1富集到15個相關的通路，PIK3CG富集到13個相關的通路，PRKCA富集到12個相關的通路。每種活性成分對應多個靶點，每個靶點連接多種成分，體現山豆根多成分、多靶點導致神經中樞受損的作用機制。同時多條通路之間是通過共有靶點連接而非獨立分開的，表明各條通路之間可能協同作用在山豆根導致神經系統受損中發生作用。

Fig 4 Toxic component-target-pathway network of Sophora tonkinensis GagnepPurple arrow represents pathway;yellow node represents active component;cyan node represents potential target.

3 討論

本研究利用網絡藥理學方法篩選出山豆根中主要毒性成分15種，包括臭豆堿Anagyrine、芒柄花黃素formononetin、山柰酚kaempferol、黃羽扇豆魏特酮lupiwighteone、苦參堿matrine、槲皮素quercetin、槐二醇sophoradiol、槐果堿sophocarpine、槐胺堿Sophoramine、槐定堿sophoridine、醉茄素 withaferine、金雀異

黃酮genistein、羽扇豆醇lupeol、金雀花堿cytisine、紫檀醇pterocarpol等。其中有毒活性成分作用于343個靶點，在Genecards數據庫中得到神經毒性靶點554個，與山豆根的靶點映射得到山豆根神經毒性靶點89個。

由PPI網絡分析篩選到9個較為重要的靶點：ACHE、CHRNA3、CHRNA4、MAOA、PARP1、PTGS1、PTGS2、TYR、XDH。其中PARP1與10種化合物存在互相關系，CHRNA4與8種化合物存在互相關系，ACHE與8種化合物存在互相關系。PARP1(poly ADP-ribose polymerase 1)是一種高度保守的細胞核內 DNA 結合蛋白，在 DNA 損傷與修復中發揮著重要的作用，DNA 損傷會誘發神經毒性，與神經系統退行性疾病的病理過程相關[6]。CHRNA4編碼煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)亞基，該基因與癲癇癥狀有關[7]。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，ACHE)能夠水解乙酰膽堿，降低突觸后膜對神經遞質敏感性，可促進β-淀粉樣蛋白(amyloid β-proteina，Aβ)纖維狀沉積[8]。

為進一步分析山豆根神經靶點所涉及的信號通路和生物過程，對山豆根神經毒性靶點進行KEGG 信號通路和GO生物過程富集分析。將89個靶點基因進行通路富集分析，山豆根導致神經系統損害主要涉及炎癥、細胞凋亡、神經突觸、離子信號通路等，如PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、含血清素的神經突觸(serotonergic synapse)、神經活性配體與受體相關作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、神經營養因子信號通路(neurotrophin signaling pathway)、多巴胺能神經突觸(dopaminergic synapse)、膽堿能突觸(cholinergic synapse)、MAPK 信號通路(MAPK signaling pathway)、鈣信號通路(calcium signaling pathway)等。不同的信號通路及相關蛋白、基因調控參與毒性作用的發生，產生復雜的相互作用。

神經活性配體受體相互作用信號通路是質膜中樞上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體的集合[9]。MAPK信號通路與神經系統損傷的發生、修復存在著緊密的聯系，通過酶、底物的交互級聯反應與其它信號通路一起參與神經損傷的過程，活化的MAPK信號通路與阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的致病機制密切相關[10]。膽堿能神經元突觸傳遞是膽堿能神經元、谷氨酸能神經元、γ-氨基丁酸等神經元之間重要的交流方式，而膽堿能神經元突觸傳遞功能異常引起早期阿爾茨海默病認知功能下降[11]。研究表明，山豆根中毒后基底節區域的膽堿能神經及毛細血管相對比較豐富，乙酰膽堿酯酶(AChE) 抑制后，乙酰膽堿蓄積而使交感神經節興奮，釋放腎上腺素、去甲腎上腺素，導致血管痙攣，基底節水腫、滲血，乃至基底節壞死、軟化[12]。當基底節受損，破壞多巴胺和乙酰膽堿的平衡，從而產生帕金森綜合征樣的錐體外系甚至錐體系的癥狀[13]。因此，山豆根中有效化合物可能通過作用與神經系統相關的靶點來干預神經系統，導致神經中毒。

大腦損傷引起興奮性神經遞質的過度釋放，使突觸后膜處于持續性去極化狀態，造成大量Ca2+內流，引發細胞內Ca2+的生化反應，而Ca2+在神經傳導、肌肉收縮和舒張、基因轉錄及信號傳導等方面起重要作用，神經細胞內Ca2+的異常引起神經細胞的凋亡[14]。山豆根有毒活性成分-靶點-通路網絡模型表明，山豆根中活性成分金雀花堿、芒柄花黃素、金雀異黃酮、山柰酚、黃羽扇豆魏特酮、苦參堿、紫檀醇、槲皮素、槐胺堿、槐定堿和醉茄素作用于靶點CHRNA7、ADORA2A、EGFR、HTR2A、DRD1、GRM5、PRKCA、ERBB2和GRM1富集于鈣離子信號通路。山豆根活性成分可能引起神經元內Ca2+穩態失調及重要基因表達異常，導致神經細胞蛋白活性異常的表達、減少神經細胞信號傳遞，導致神經細胞壞死，最終產生神經進行性病變。

山豆根的毒性主要是由于其所含的苦參堿、氧化苦參堿、金雀花堿、槐果堿等生物堿引起，其中苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、金花雀堿是引起山豆根臨床中毒反應的化學成分，而苦參堿是引起山豆根毒性反應的主要化學成分[1]。小鼠腹腔注射不同濃度苦參堿，高劑量苦參堿組小鼠出現活動減少、行動遲緩、雙目緊閉、震顫、輕度不安、前肢稍震顫等現象，部分小鼠出現興奮、發抖；組織病理顯示小鼠腦神經系統發生退行性變[15]。利用Swiss target prediction在線數據庫預測到苦參堿的靶點為BCHE、CHRNA3、CHRNA4、CHRNA7、DPP4、DRD1、EPHX1、GRM5、HTR1D、MME、PARP1、SLC6A3、DRD2。nAChRs與多種中樞神經系統的功能有關，如隨意運動、記憶力及注意力等[8]。苦參堿作為山豆根的主要有效成分，可能通過作用與nAChRs相關的靶點基因，如CHRNA3、CHRNA4、CHRNA7，使得受體釋放的Ca2+異常，導致突觸前釋放的GABA減少。

山豆根候選毒性成分槐花二醇、紫檀醇、金雀異黃素、羽扇豆醇、紫藤皂醇A、臭豆堿的口服利用度OB值未能達到30%。研究表明，山豆根中生物堿的含量占山豆根干質量的0.93%，其中苦參堿0.52%、氧化苦參堿0.35%，而其它的微量成分如金雀花堿，含量太低難以引起毒性反應[4]。藥物的口服生物利用度低將增大機體毒性的可能性，臨床用藥中山豆根超過藥典規定劑量(6 g)時易發生急性中毒反應[3]，而長時間服用山豆根會出現蓄積性中毒，由此可見，超劑量使用是山豆根中毒最根本的原因[2]。山豆根存在毒性反應且涉及多個系統，其毒性呈劑量依賴性。因此，山豆根過量服用導致中毒可能是由于某些有效化學成分口服利用度低，但過量服用造成有效成分在體內蓄積，影響與膽堿能突觸、神經突觸、鈣離子通路等關鍵基因的表達。而膽堿能突觸、神經突觸、鈣離子通路信號通路中重要因子差異表達，誘導或加速神經細胞蛋白活性表達的異常、減少神經細胞信號傳遞，從而導致神經中毒。

綜上，本研究運用網絡藥理學的方法研究山豆根神經毒性的作用機制，超量服用山豆根，使口服利用度較低的化學成分，如槐花二醇、紫檀醇、金雀異黃素、羽扇豆醇、紫藤皂醇A、臭豆堿在體內蓄積，調控與膽堿能突觸、神經突觸、鈣離子通路等關鍵基因的表達。而膽堿能突觸、神經突觸、鈣離子通路信號通路中重要基因的差異表達，導致神經細胞蛋白異常表達，減少神經細胞信號傳遞，從而導致神經中毒。藥有個性之特長，山豆根作用于神經毒性是多靶點、多通路、多功能的復雜網絡結構機制，其主要通路不僅直接參與神經系統相關的通路，還通過炎癥、細胞凋亡、離子信號通路等來干預和影響神經系統。但由于網絡藥理學研究存在局限性，基于系統生物學雖能夠較為直觀地系統地預測化學成分與作用靶點結合，但未能明確化學成分對關鍵基因表達的上調與下調關系，尚不能完全揭示藥物在生物體內狀況。因此以網絡藥理學研究方法為基點，進一步開展實驗工作以闡明山豆根神經毒性的多靶點、多通路、整合調節的復雜網絡結構機制。