HPLC法同時測定蒿茶中3種有機酸的含量

王 絨，楊 勇*，施曉琪，鄒雯燕，付晨偉,紀香峰，喻春皓*，崔 超，孔 晶

(1.淮陰工學院 化學工程學院制藥工程系，江蘇 淮安 223003；2.江蘇省特色資源開發與藥用研究重點實驗室，江蘇 淮安 223003)

蒿茶又名蘆蒿、藜蒿，是以菊科蒿屬(CompositaeArtemisia)蔞蒿(ArtemisiaselengensisTurcz. ex Bess.)的純野生香蔞尖為原料，采用現代制茶工藝加工而成的茶品，是集食用與藥用于一身的養身保健佳品，每年清明節前后采摘加工而成的品質尤佳。蔞蒿性平、味甘，全草入藥，有消炎、止血、化痰、鎮咳等功效[1]。已有研究發現，蔞蒿中的化學成分主要包括黃酮、酚酸、萜類、香豆素、維生素和生物堿等[2-8]，其中黃酮和酚酸類成分被認為是其重要的活性成分[2,9-10]。有機酸類成分是中藥中常見的一類組成物質，具有抗炎、活血化瘀等多種藥理活性[11-16]。目前，關于蒿茶中有機酸的研究鮮有報道[10]。由于蒿茶作為一種茶葉飲品，沖泡后，其中有機酸類成分必然為人們飲用。因此，有必要測定其含量進行蒿茶的質量評價。本文對蒿茶的水提液進行了研究，發現了多種有機酸成分。在此基礎上，本文以蒿茶中的有機酸類成分為指標，考察了蒿茶的提取方法，建立HPLC含量測定方法，并基于不同產地的蒿茶樣品進行研究，旨在為進一步提高蒿茶的質量評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀、G1315B型DAD檢測器(美國Agilent公司)；FA2004型電子天平(上海電子科技有限公司)；H1850R型醫用離心機(長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司)；超聲清洗儀(天津市瑞普電子儀器公司)；Smart-S15UV型實驗室純水系統(上海和泰儀器有限公司)。

新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品(中藥對照品實驗耗材中心，批號分別為01330-0226、01330-1008、01330-0418)；蒿茶樣品分別購于茶葉店鋪，共5個產地，江蘇(批號：190528)、山西(批號：190101)、安徽(批號：190301)、甘肅(批號：181201)、陜西(180801003)。甲醇、乙腈和甲酸均是色譜純；其他試劑均是分析純；水是超純水。

1.2 方法

1.2.1提取工藝優化

蒿茶作為茶葉飲品，沖泡后為人飲用，因此采用恒溫浸泡提取工藝。通過L9(43)正交試驗考察料液比、提取時間、提取溫度、提取次數對總有機酸成分提取的影響，參數設置見表1。

表1 蒿茶提取工藝因素水平表

1.2.2溶液制備

(1) 對照品儲備溶液的制備

精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品適量，加入甲醇溶解，配置成濃度均是0.8 mg·mL-1的對照品儲備液。需要使用時精密吸取各個對照品儲備液適量混勻，再經過稀釋成混合對照品溶液即可(新綠原酸16 μg·mL-1、綠原酸48 μg·mL-1、隱綠原酸16 μg·mL-1)。

(2) 供試品溶液制備

以江蘇蒿茶為例，按照下述步驟，制備5種不同產地蒿茶的供試品溶液。取江蘇蒿茶(批號：190528)約1.0 g，按照正交試驗最佳工藝條件，加30 mL超純水，于水浴鍋80℃恒溫浸泡50 min，共提取3次，合并3次的提取液，離心，過濾，至100 mL的容量瓶中，定容，搖勻，經0.45 μm的濾膜過濾，即得到供試品溶液。

1.2.3色譜條件優化

本試驗在最優提取條件下，采用Kromasil 100-5C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；柱溫：30℃；檢測波長320 nm；考察不同流動相體系：甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水對蒿茶HPLC方法分離效果的影響。

2 結果與分析

2.1 蒿茶提取工藝

由表2結果可知，浸泡提取主次影響因素為：料液比>提取次數>提取時間>提取溫度，最佳提取條件為料液比1︰30 g·mL-1，提取時間為50 min，溫度為80℃，提取次數為3次。

表2 蒿茶提取工藝正交設計表

2.2 HPLC色譜條件優化

甲醇和乙腈為流動相常用溶劑。本研究考察了不同流動相體系：甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水(見圖1)，分別在320 nm檢測波長進行HPLC分析，發現流動相為乙腈-0.1%甲酸時，分離時間與分離效果均優于其他三種流動相體系，因此，選擇乙腈-0.1%甲酸水為流動相。

圖1 不同流動相下HPLC譜圖

2.3 方法學考察

2.3.1系統適應性試驗

在“2.2”色譜條件下進行HPLC分析，混合對照品、江蘇蒿茶供試品溶液與陰性對照的色譜圖如圖1所示，各組分分離度均大于1.5。

注：1: 新綠原酸；2: 綠原酸；3: 隱綠原酸

圖2 對照品混標和供試品溶液的HPLC色譜圖

2.3.2線性關系考察

分別精密吸取混合對照品溶液1, 2, 4, 8, 16和20 μL，每個體積分別重復進樣3次，注入液相色譜儀， 按照“2.1”色譜條件下分析，記錄色譜圖，以進樣量(μg)為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，進行線性回歸，結果見表3。新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸這3種有機酸的峰面積在一定質量范圍內線性關系良好。

表3 3種有機酸的線性關系

2.3.3檢測限與定量限

精密量取“2.3.1”下對照品儲備溶液適量，逐級稀釋后按“2.1”色譜條件下分析，測得新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的檢測限分別為1.1, 2.4, 3.4 ng，定量限分別為3.7, 7.8, 11.4 ng。

2.3.4精密度試驗

按“2.3.1”項制備混合對照品溶液，在“2.1”色譜條件下，重復測定6次，結果顯示新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸峰面積的RSD值分別為3.34%、3.00%、3.47%，說明儀器精密度良好。

2.3.5穩定性試驗

取“2.3.2”項下制備的供試品溶液，在“2.1”色譜條件下，分別在0, 2, 4, 8, 16, 24 h內進行測定，結果顯示，新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸峰面積的RSD值分別為1.10%、0.40%、1.48%，表明供試品在24 h內穩定。

2.3.6重復性試驗

取“2.3.2”項下制備的供試品溶液6份，在“2.1”色譜條件下進行測定，結果顯示，新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸峰面積的RSD值分別為2.05%、0.47%、3.35%，表明該方法的重復性良好。

2.3.7加樣回收率試驗

精密稱取0.1 g已知含量的蒿茶9份，再分別精密加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品溶液適量，按“2.3.2”項下制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下，進行HPLC分析，計算平均加樣回收率介于96.9%～104.6%，RSD介于2.0%～2.4%，表明該方法準確可靠(見表2)。

表4 加樣回收率試驗測定結果

2.3.8樣品含量測定

精密稱取5批蒿茶樣品，按“2.3.2”項下供試品溶液制備方法制備，在“2.1”色譜條件下進行測定，計算各成分含量(見表5)。

表5 不同產地蒿茶中有機酸的含量測定結果 (mg·g-1)

由表5可知，不同產地的蒿茶中有機酸含量有所差異，江蘇>陜西>安徽>山西>甘肅，其中江蘇產地蒿茶中有機酸含量最高達到70.406 mg·g-1，甘肅產地蒿茶含量最低為2.849 mg·g-1，兩者相差約25倍。

3 結論

本研究建立了HPLC法測定蒿茶中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸3種有機酸的含量，方法操作簡便，具有良好的精密度、穩定性、重復性。將之用于考察提取工藝對有機酸含量的影響，并研究不同產地的蒿茶樣品中有機酸的含量差異。研究結果發現，不同產地的蒿茶樣本中，均檢測到3種有機酸，有機酸含量范圍為2.849～70.406 mg·g-1，含量最高相差約25倍。茶葉中的酚酸類成分具有抗氧化、降血脂等作用，本研究結果為蒿茶作為保健產品的開發及蒿茶的質量評價提供了一定的科學依據。