基于蛇床子配方顆粒的標準湯劑質量標準

李軍山 李雪利 高杰 高晗 張肖建 孫福仁

摘要? 目的：對蛇床子飲片進行標準湯劑制備，并研究其質量標準。方法：按照中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求中的相關規定，對15批產自不同地區的蛇床子飲片進行標準湯劑制備，對其主含成分蛇床子素進行含量測定，計算15批標湯的出膏率及蛇床子素的含量轉移率，并對高效液相色譜法（HPLC）特征圖譜進行方法建立。結果：蛇床子素轉移率為3.35% ～6.09%，出膏率為14.10% ～19.93%。對特征譜圖中的8個特征峰中的5個色譜峰進行了指認。結論：蛇床子飲片標準湯劑符合中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求中的相關規定，測定方法精密度、穩定性和重復性良好，可以為蛇床子配方顆粒的質量控制提供參考。

關鍵詞? 蛇床子;蛇床子素;標準湯劑;轉移率;出膏率;含量測定;特征圖譜;中藥化學

Study on Quality Standard of Standard Decoction of Based on Shechuangzi Formula Granules

LI Junshan1，2，LI Xueli1，GAO Jie1，GAO Han1，ZHANG Xiaoian1，SUN Furen1

（1 Shineway Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Shijiazhuang 051430，China; 2 TCM Formula Granule Engineering Technology Research Center of Hebei，Shijiazhuang 050091，China）

Abstract Objective： To prepare the standard Shechuangzi Decoction Pieces and study its quality standard. Methods： According to the relevant provisions of the technical requirements for the quality control and standard formulation of Chinese medicine formula granules，a total of 15 batches of Shechuangzi Decoction Pieces from different origins were prepared for standard decoction.The content of osthole in its main component was determined，the cream extraction rate and the content transfer rate of osthole in 15 batches of standard decoction were calculated，and the HPLC characteristic map method was developed. Results： By analyzing the determination results of 15 batches of standard decoction of Shechuangzi Decoction Pieces，the transfer rate of osthole ranged from 3.35% to 6.09%.The extraction rate was 14.10%-19.93%.A HPLC characteristic atlas analysis was established，and 5 chromatographic peaks were identified from 8 characteristic peaks in characteristic atlas. Conclusion： The standard decoction of Shechuang zi Decoction Pieces meets the relevant regulations in the technical requirements for quality control and standard formulation of Chinese medicine formula granules.The determination method has good precision，stability and repeatability，and can provide reference for the quality control of the Shechuangzi Formula Granules

Keywords? Fructus Cnidii; Osthole; Standard decoction; Transfer rate; Extraction rate; Determination of content; Characteristic chromatograms; Chemistry of Chinese medicine

中圖分類號：R283 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.005

蛇床子為傘形科植物蛇床 Cnidium monnieri （L.）Cuss.的干燥成熟果實，又名蛇米（《本經》）、蛇珠（《吳普本草》）、蛇床仁（《藥性論》）、野茴香（江西《草藥手冊》）等。始載于《神農本草經》，列為上品[1-2]，李時珍謂：“蛇虺喜臥子下食其子，故有蛇床、蛇粟諸名”。香豆素類成分為蛇床子的主要藥效成分，其中蛇床子素含量最高，約占總香豆素的60%，其他香豆素類成分有水合橙皮內酯、花椒毒素、花椒毒酚、歐芹屬素乙、佛手柑內酯、白芷素等。用于陰癢帶下，濕疹瘙癢，濕痹腰痛，腎虛陽痿，宮冷不孕。用量3～10 g，外用適量，多煎湯熏洗，或研末調敷[3-5]。研究表明，蛇床子對中樞神經系統、心血管系統、內分泌系統、免疫系統等均具有好的作用，常用于治療外科、婦科、皮膚等方面的疾病[6]。

中藥飲片標準湯劑可以標化不同的臨床用藥形式，提高臨床用藥的準確性和劑量的一致性[7]。配方顆粒的生產工藝參數、質量控制方法和有效指標成分的選擇等方面研究均須匹配標準湯劑等的相關研究。本研究按照標準湯劑制備方法，以采收自15個不同產地的蛇床子飲片為原料制備標湯，對蛇床子素進行含量測定，計算蛇床子轉移率和標湯出膏率范圍，并建立特征圖譜方法，為提高蛇床子配方顆粒的質量控制水平和規范其臨床用藥提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司，型號：CPA225D）;電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司，型號：JM-A5002）;水循環真空泵（上海申生科技有限公司）;熱風循環鼓風干燥箱（太倉精宏儀器設備有限公司，型號：DHG-9140A）;高效液相色譜儀（日本島津公司，日本，型號：LC-20AT）;超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司，型號：KH3200E）。

1.2 試劑 蛇床子素對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號：110822-201710）;歐前胡素對照品（中國食品藥品鑒定研究院，批號：110826-201616）;對香豆酸（成都普菲德生物技術有限公司，批號：17082310）;花椒毒素（成都普菲德生物技術有限公司，批號：HA061509198）;花椒毒酚（成都普菲德生物技術有限公司，批號：HX106886198）甲醇（成都普菲德生物技術有限公司，批號：20180820）;乙腈（天津科密歐化學試劑有限公司，色譜純）;甲醇（天津科密歐化學試劑有限公司，分析純）;水（實驗室自制，去離子水）。

1.3 分析樣品 15批不同產地蛇床子藥材，經河北省藥品檢驗研究院孫寶惠鑒定為正品，樣品來源信息見表1。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相組成A（水）﹕B（乙腈）為35∶ 65;檢測波長為322 nm。理論板數按蛇床子素峰計算應不低于3 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 取蛇床子素對照品10 mg，精密稱定，加乙醇適量制成每l mL含20 μg的溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品研細，稱取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無水乙醇25 mL，密塞，稱重，超聲處理30 min，放冷，再次稱重，補足減失的重量，搖勻，濾過，即得[14-15]。

2.1.4 專屬性試驗 取空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液，分別采用2.1.1色譜條件，進行HPLC色譜測定。樣品與對照品在同一保留時間有相同的波峰出現，而空白溶液則無相應的峰，證明含量測定專屬性良好。

2.1.5 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，進樣分析，記錄蛇床子素峰面積，并以蛇床子素峰面積為縱坐標Y，進樣蛇床子素的量為橫坐標X，制作標準曲線。得回歸方程Y=873 21X+462 7.5，r=0.999 9，結果表明蛇床子素在0.026 4～0.527 6 μg，范圍內相關系數為0.999 9線性關系良好。

2.1.6 精密度試驗 取蛇床子標準湯劑樣品（標1）按“2.2.3”所規定方法制備供試品溶液，連續進樣6針，測定峰面積（蛇床子素）的RSD值為0.31%，說明設備具有良好的精密度。

2.1.7 供試品溶液穩定性試驗 取同一個供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，15 h時進樣測定蛇床子素含量，計算各樣品中峰面積（蛇床子素）的RSD值為0.53%，說明15 h內此樣品溶液穩定。

2.1.8 重復性試驗 取蛇床子標準湯劑樣品（標1）供試品6份，每份約0.1 g，精密稱定。按“2.2.3”所規定方法處理標湯劑樣品，按“2.2.1色譜條件”進樣測定，計算供試品中蛇床子素含量，6份供試品中蛇床子素含量的RSD為0.81%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 回收率試驗 取蛇床子標準湯劑樣品（標1）供試品9份，每份約0.05 g精密稱定，按每3份為一組，每組精密加入蛇床子素對照品相當于蛇床子標準湯劑所含蛇床子素量的80%，100%，120%，置具塞錐形瓶中，按2.2.1色譜條件項下進樣10 μL測定，蛇床子素平均加樣回收率為100.80%，加樣回收率RSD為1.51%。見表2。

2.1.10 樣品測定結果 按“稱取蛇床子飲片200 g，以水為提取溶媒，提取2次[8]。第一煎加水1 600 mL，先泡30 min，然后開始加熱，煮沸后計時30 min;第二煎加水1 200 mL，煮沸后計時20 min。合并2次煎液，用300目的篩網趁熱過濾。濾液迅速冷卻，用旋轉蒸發器低溫（60 ℃，-0.085 MPa）濃縮至適當相對密度的流浸膏，放置在玻璃蒸發皿中冷凍干燥，制成標準湯劑干燥粉末”[9-13]。所述方法制備15批標準湯劑，計算標準湯劑出膏率即為標準湯劑干燥粉末（m2）與蛇床子飲片（m1）：

出膏率= m2 m1

按“蛇床子及標準湯劑中蛇床子素含量的測定方法”測定蛇床子飲片、蛇床子標準湯劑的含量[14-15]：

含量轉移率= 標準湯劑含量×出膏率 飲片含量 ×100%

15批蛇床子標準湯劑出膏率在14.10% ～19.93%，出膏率平均值為15.84%，SD值為1.71;標準湯劑中蛇床子素含量范圍為3.26～5.85 mg/g，含量平均值為4.63 mg/g，SD值為0.74;蛇床子素含量轉移率范圍為3.35% ～6.09%，轉移率均值為4.72%，SD值為0.96。

2.2 特征圖譜測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent公司ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.1%冰醋酸溶液[16]，按下表比例進行梯度洗脫;檢測波長為310 nm;流速1 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別取蛇床子素、花椒毒素、花椒毒酚、歐前胡素和對香豆酸對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每l mL含蛇床子素30 μg、花椒毒素20 μg、花椒毒酚20 μg、歐前胡素10 μg、對香豆酸20 μg的混合溶液[17-18]，即得。見圖1。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品0.2 g，精密稱定，置磨口三角瓶中，精密量取70%乙醇25 mL，加入三角瓶中，稱重，密塞，超聲處理20 min，放冷，再次稱重，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得[19]。見圖2。

2.2.4 精密度試驗 取蛇床子標準湯劑樣品（標1），按“2.2.3”所述方法處理樣品，重復進樣6次，以蛇床子素為S峰，計算其他主要色譜峰的RRT及RPA，結果顯示各峰RRT的RSD<0.9%，RPA的RSD<2.9%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 供試品溶液穩定性試驗 取同一批標湯制備的樣品溶液，按“2.2.1色譜條件”規定，分別在0，3，6，9，12，15，18 h進樣分析，記錄色譜圖，以蛇床子素為S峰，計算其他主要色譜峰的RRT及RPA，結果顯示各峰RRT的RSD<0.6%，RPA的RSD<2.7%，表明在18 h內樣品溶液穩定。

2.2.6 重復性試驗 取蛇床子標準湯劑樣品（標1），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，制備平行樣品6份，按2.2.1所述條件，進樣分析，記錄色譜圖，以蛇床子素為S峰，計算其他主要色譜峰的RRT及RPA，結果顯示各峰RRT的RSD<1.1%，RPA的RSD<3.0%。

2.2.7 樣品測定結果 取15批蛇床子標準湯劑，按2.2.1色譜條件測定HPLC圖譜。測定完后把15批HPLC圖譜導入相似度評價系統軟件中進行分析。見圖3。15批蛇床子標準湯劑共呈現8個共有特征峰，以8號峰蛇床子素為參照峰，計算8個共有色譜峰的RRT及RPA。見表5、表6。

結果表明，15批蛇床子標準湯劑各特征峰的RRT均在規定值：峰1（0.20）、峰2（0.29）、峰3（0.33）、峰4（0.35）、峰5（0.58）、峰6（0.61）、峰7（0.96）、峰8（1.00）±5%范圍內。

3 討論

3.1 提取溶劑考察 蛇床子配方標準湯劑特征圖譜樣品制備方法考察了純化水、無水乙醇、100%甲醇、70%甲醇、20%甲醇、70%乙醇、20%乙醇共7種提取溶劑，以色譜峰個數、基線穩定性等為考察指標，最終確定用70%乙醇進行樣品溶液制備。

3.2 流動相選擇 特征圖譜在條件摸索階段有機相考察了流動相：甲醇[20]、乙腈，水相考察了0.1%磷酸，0.1%冰醋酸及水，通過對比色譜圖發現流動相為乙腈-0.1%冰醋酸時，色譜圖基線平穩，色譜峰分離良好，因此選用乙腈-0.1%冰醋酸作為流動相。

3.3 色譜柱及柱溫 考察了ZORBAX Eclipse Plus C18及InertSustain AQ-C18，柱溫25 ℃、30 ℃、35 ℃，結果顯示ZORBAX Eclipse Plus C18，柱溫30 ℃時效果最優。

3.4 提取用純化水、飲用水考察 先后考察了純化水、飲用水提取的差異，飲用水提取出膏率為15.30%，蛇床子素含量為3.17 mg/g，含量轉移率為4.58%;純化水提取出膏率為14.98%，蛇床子素含量為3.59 mg/g，含量轉移率為5.07%，從實驗結果可以看出提取效果受加水量多少影響較小。

3.5 煎煮時間考察 考察了一煎20/二煎20 min、一煎30/二煎20 min、一煎40/二煎30 min及一煎60/二煎40 min，結果出膏率為14.76%、15.31%、15.52%、15.50%，蛇床子含量轉移率為3.21%、3.98%、3.63%、3.70%，標湯中蛇床子素含量轉移率和出膏率呈先上升后趨于平穩的狀態。

3.6 加水量考察 考察了8/6倍、10/8倍、11/9倍、15/13倍及20/18倍加水量對提取效果影響，結果出膏率為15.30%、16.41%、17.14%、18.31%、19.09%，蛇床子素含量轉移率為4.58%、4.79%、6.52%、8.47%、10.06%，標湯中出膏率隨加水量增加有提升，蛇床子含量轉移率亦有上升趨勢，所以標準湯劑制備方法應該統一。

我們根據中藥配方顆粒標準制定相關要求，制備了15批蛇床子標準湯劑，并對標湯出膏率及蛇床子素轉移率進行了測定，同時確定了特征圖譜測定方法及評價指標，建立了蛇床子標準湯劑質量標準，為確定蛇床子配方顆粒生產及質量標準提升奠定基礎。

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（2019-03-19收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：河北省科技計劃項目（16272510）;河北省重點研發計劃項目（17272505D）

作者簡介：李軍山（1965.01—），男，本科，正高級工程師，技術總監，研究方向：從事配方顆粒質量標準及制備工藝研究，E-mail：swljs@sina.com

通信作者：李雪利（1988.04—），女，本科，工程師，工藝研究員，研究方向：從事配方顆粒質量標準及制備工藝研究，E-mail：lixuelisherly@163.com