基于超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜的胃復(fù)春片化學(xué)成分研究

周丹丹 鄒秦文 林瑞超

摘要?目的：基于超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）技術(shù)對胃復(fù)春片的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了全面的研究，對主要化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒定。方法：采用Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm），以0.05%甲酸水-乙腈為流動相的梯度洗脫進(jìn)行分離。質(zhì)譜采用正、負(fù)離子檢測模式、全掃描及自動觸發(fā)二級質(zhì)譜掃描功能（Full MS/dd MS2）采集數(shù)據(jù)。通過化合物的最大紫外吸收波長、精確相對分子質(zhì)量及二級碎片離子信息，與對照品的保留時間、mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)報道進(jìn)行比對，鑒定胃復(fù)春片的主要化學(xué)成分。結(jié)果：共鑒定出164種化學(xué)成分，其中包括人參皂苷類42個、黃酮類97個、二萜類19個、其他6個。結(jié)論：UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確、較全面地鑒定胃復(fù)春片中化學(xué)成分，為明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及提升質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞?胃復(fù)春片;化學(xué)成分;UPLC-Q-Orbitrap HRMS;人參皂苷;黃酮;二萜

Abstract?Objective：Based on ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap mass spectrometry（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）technology，to thoroughly study the material basis of Weifuchun Tablets，and to quickly identify the main chemical components.Methods：The analysis was performed on a Thermo Hypersil GOLD C18 column（150 mm×4.6 mm，3 μm）.The mobile phase comprised of water containing 0.05% formic acid and acetonitrile was used for gradient elution.Mass spectrometry adopts positive and negative ion detection mode，full scan and automatic trigger secondary mass spectrometry scan function（Full MS/dd MS2）to collect data.By comparing the compound′s maximum ultraviolet absorption wavelength，accurate relative molecular mass and secondary fragment ion information with the reference substance retention time，mzVault 2.0 mass spectrometry database and related literature reports，the main chemical components of Weifuchun tablets were identified.Results：A total of 164 chemical constituents including 42 ginsenosides，97 flavonoids，19 diterpenoids and 6 other compounds，were identified.Conclusion：UPLC-Q-Orbitrap HRMS technology can quickly，accurately，and comprehensively identify the chemical composition of Weifuchun tablets，which provides a theoretical basis for clarifying the basic research of drug efficacy and improving quality standards.

Keywords?Weifuchun Tablet; Chemical Constituents; UPLC-Q-Orbitrap HRMS; Ginsenosides; Flavonoids; Diterpenoids

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.001

胃復(fù)春片收載于《中華人民共和國藥典》[1]2015年版一部，由紅參、香茶菜、麩炒枳殼3味中藥組成，臨床上主要用于慢性萎縮性胃炎、胃癌前期病變、淺表性胃炎、胃十二指腸潰瘍的治療[2]。中藥復(fù)方的化學(xué)成分研究有助于明確中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，是提升質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。目前，胃復(fù)春片中化學(xué)成分研究的報道較少。鐘靜華[3]采用HPLC-DAD-ESI-MSn以及HPLC/Q-TOF-MS技術(shù)對胃復(fù)春片進(jìn)行分析，共鑒定出60個化學(xué)成分，初步明確了其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。超高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜技術(shù)具有多種質(zhì)譜掃描方式，其高靈敏度、高分辨率及高質(zhì)量準(zhǔn)確度等特點，能夠?qū)崿F(xiàn)對復(fù)雜的中藥復(fù)方中化學(xué)成分的篩查、識別和快速鑒定[4-5]。本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，通過化合物的最大紫外吸收波長、精確相對分子質(zhì)量及二級碎片離子信息，與對照品的保留時間和mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫信息進(jìn)行匹配并參考相關(guān)的文獻(xiàn)報道，共鑒定出胃復(fù)春片中164個化學(xué)成分。

1?儀器與試藥

1.1?儀器

超高效液相色譜儀（配有二元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、自動控溫箱）通過HESI離子源與Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀鏈接，數(shù)據(jù)處理及采集軟件為Xcalibur 4.2（賽默飛世爾科技公司，美國，型號：UltiMate 3000-Q-Orbitrap）;電子天平（梅特勒-托多利儀器（上海）有限公司，型號：MS204TS/02）;超聲波清洗儀（Elma公司，德國，型號：P120H）：Milli-Q型超純水（Millipore公司，美國，型號：ADVANTAGE A10）。

1.2?試劑

對照品柚皮苷（批號：110722-201815）、橙皮苷（批號：110721-201818）、冬凌草甲素（批號：111721-201704）、人參皂苷Rb1（批號：110704-202028）、人參皂苷Rg1（批號：110703-201933）、20（S）-人參皂苷Rg2（批號：111779-200801）、人參皂苷Re（批號：110754-202028）、人參皂苷Rd（批號：111818-201603）、20（S）-人參皂苷Rg3（批號：110804-201504）均購自中國食品藥品檢定研究院。人參皂苷Rh4（批號：174721-08-5）、人參皂苷Rg5（批號：186763-78-0）、人參皂苷Rk1（批號：494753-69-4）、人參皂苷Rk3（批號：364779-15-7）購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司;乙腈為HPLC級（美國Honeywell公司），甲酸為LC-MS級（美國Fisher Scientific公司），其他為分析純（上海泰坦科技股份有限公司）。

1.3?分析樣品

胃復(fù)春片（批號：19066109）為杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司提供。

2?方法與結(jié)果

2.1?色譜條件

色譜柱為Thermo Hypersil GOLD C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）;柱溫：30 ℃;流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣體積：5 μL;DAD檢測190～400 nm。流動相為0.05%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序如下：0～6 min，5%B→20%B;6～12 min，20%B;12～20 min，20%B→30%B;20～28 min，30%B→50%B;28～35 min，50%B→95%B;35～41 min，95%B→5%B。

質(zhì)譜條件：HESI離子源，正負(fù)離子掃描。鞘氣體積流量40 L/min;輔助氣體積流量10 L/min;噴霧電壓3.5 kV;離子傳輸管溫度320 ℃;輔助氣溫度350 ℃;掃描模式：Full MS/dd-MS2;正離子模式下一級掃描范圍m/z 150～1 500，負(fù)離子模式下一級掃描范圍m/z 100～1 500，分辨率70 000;AGC target為106，最大注入時間為100 ms，頂點觸發(fā)前五強的離子做MS2;二級掃描分辨率17 500，AGC target為105，最大注入時間為50 ms，Stepped NCE為10%、20%、30%。

2.2?對照品溶液的制備

精密稱取柚皮苷、橙皮苷、冬凌草甲素、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rh4、人參皂苷Rg1、20（S）-人參皂苷Rg2、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、20（S）-人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg5、人參皂苷Rk1、人參皂苷Rk3對照品適量，加甲醇溶解制成濃度約為50 μg/mL的對照品溶液。

2.3?供試品溶液制備

取胃復(fù)春片20片，除去薄膜衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL后，稱定重量，超聲（功率380 W，頻率37 kHz）提取45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇溶液補足重量。搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm濾膜，即得。

2.4?結(jié)果

采用UPLC-Q-Orbitrap高分辨質(zhì)譜對胃復(fù)春片進(jìn)行化學(xué)成分研究。正負(fù)離子模式下得到的總離子流（TIC）色譜圖如圖1。紅參、枳殼和香茶菜的主要活性成分可為人參皂苷類，黃酮類和二萜類化合物。根據(jù)不同類型化合物的最大紫外吸收波長可以把色譜峰進(jìn)行分類：無紫外吸收的化合物為人參皂苷類;波長在254～280 nm為黃酮及苷類;波長在220～240 nm歸類為二萜類化合物。通過各類化合物的質(zhì)譜裂解碎片分析、mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫篩查并結(jié)合對照品以及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比，共鑒定出164種化學(xué)成分，包括42個人參皂苷類、97個黃酮類、19個二萜類和6個其他化合物，結(jié)果見表1。

2.4.1?人參皂苷類化合物的鑒定與分析?按照其母核骨架的不同，可以分為原人參二醇型（PPD）、原人參三醇型（PPT）、齊墩果酸型（OA）以及特殊類型（如，擬人參皂苷F11、人參皂苷Rk1）等。據(jù)文獻(xiàn)報道[18，23]，人參皂苷在負(fù)離子模式下具有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，其分子離子峰通常為[M+HCOO]-和[M-H]-。人參皂苷的糖苷鍵容易斷裂，失去相應(yīng)的中性碎片離子，如：162 Da（一分子的葡萄糖）、146 Da（一分子的鼠李糖）、132 Da（一分子的木糖或阿拉伯糖）等，最終生成苷元以及苷元上C-20位脫掉側(cè)鏈后的特征碎片離子。PPD型的特征離子為m/z 459 和m/z 375;PPT型的特征離子為m/z 475和m/z 391;OA型的特征離子為m/z 569和m/z 523。以峰105為例進(jìn)行詳細(xì)的說明。峰105的保留時間為26.98 min，-ESI模式下的[M-H]-峰為m/z=784，連續(xù)脫去一分子鼠李糖和一分子葡萄糖生成m/z=637[M-H-Rha]-和m/z=475[M-H-Rha-Glu]-，以及苷元上C-20位脫掉側(cè)鏈后的碎片離子m/z=391[M-H-Rha-Glu-C6H12]-。根據(jù)相對分子質(zhì)量的實測值784.496 7及元素組成分析，推測該化合物的分子式為C42H72O13（1.09 ppm）。通過與對照品的保留時間及質(zhì)譜圖的比較，確定該化合物為20（S）-人參皂苷Rg2，質(zhì)譜裂解途徑見圖2。

2.4.2?黃酮及其苷類化合物的鑒定與分析?枳殼中主要含有二氫黃酮及苷類和多甲氧基黃酮及苷類等。二氫黃酮苷類的糖苷鍵容易斷裂，其苷元的C環(huán)容易失去CO和氧原子，易發(fā)生RDA裂解，生成特征性離子[25]。以柚皮苷為例進(jìn)行詳細(xì)的說明。峰40的tR為13.28 min，-ESI模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z=579[M-H]-，脫去糖鏈生成苷元m/z=271[M-H-Glu-Rha]-，再發(fā)生RDA裂解生成特征性碎片離子m/z=151[M-H-Glu-Rha-C8H8O]-。碎片離子m/z=459[M-H-C8H8O]-是由準(zhǔn)分子離子峰發(fā)生RDA裂解而生成。根據(jù)相對分子質(zhì)量的實測值579.171 0及元素組成分析，推測該化合物的分子式為C27H32O14（0.33 ppm）。通過與對照品的保留時間及質(zhì)譜圖的比較，確定該化合物為柚皮苷，質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

多甲氧基黃酮及苷類化合物含有多個甲氧基，其質(zhì)譜裂解規(guī)律[26]主要為糖鏈的斷裂，失去多個CH3、中性分子H2O、CO以及RDA裂解。以橘皮素為例進(jìn)行詳細(xì)的說明。峰148的tR為31.67 min，+ESI模式下的準(zhǔn)分子離子峰為m/z=373[M+H]+，連續(xù)脫去3個CH3以及發(fā)生RDA裂解，分別生成m/z=358[M+H-CH3]+、m/z=343[M+H-2CH3]+、m/z=328[M+H-3CH3]+和m/z=211[M+H-3CH3-C9H8O]+。碎片離子m/z=343繼續(xù)脫去一分子CO、H2O以CH3，生成m/z=315[M+H-2CH3-CO]+、m/z=297[M+H-2CH3-CO-H2O]+、m/z=297[M+H-3CH3-CO]+的碎片離子。根據(jù)相對分子質(zhì)量的實測值373.128 0及元素組成分析，推測該化合物的分子式為C20H20O7（-0.43 ppm）。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15，17]推測該化合物為橘皮素，質(zhì)譜裂解途徑見圖4。

2.4.3?二萜類化合物的鑒定與分析?香茶菜中的主要化學(xué)成分為二萜類化合物。以冬凌草甲素為例進(jìn)行詳細(xì)的說明。冬凌草甲素在C-7位為一個半縮酮、C15位為一個酮羥基和多個羥基。因此，其質(zhì)譜裂解規(guī)律[14]主要為失去H2O、CO2、CO以及CH2O。峰59的保留時間為17.77 min，-ESI模式下的準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z=363，脫去一分子CH2O生成m/z=333[M-H-CH2O]-。[M-H]-峰連續(xù)脫去2個分子的H2O以及一分子CO和一分子CO2，產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子m/z=345[M-H-H2O]-、m/z=327[M-H-2H2O]-、m/z=299[M-H-2H2O-CO]-和m/z=283[M-H-2H2O-CO2]-。此外，特征離子m/z=333連續(xù)脫去一分子H2O和一分子CO2生成m/z=315[M-H-CH2O-H2O]-和m/z=271[M-H-CH2O-H2O-CO2]-的碎片離子。根據(jù)相對分子質(zhì)量的實測值363.180 9及元素組成分析，推測該化合物的分子式為C20H28O6（1.75 ppm）。通過與對照品的保留時間及質(zhì)譜圖的比較，確定該化合物為冬凌草甲素，質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

3?討論

本研究采用UPLC-Q-Orbitrap MS法對胃復(fù)春片中的主要化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒定。采用正、負(fù)離子同時掃描和Full MS/dd MS2模式采集數(shù)據(jù)。按照色譜峰的最大紫外吸收情況進(jìn)行分類后，根據(jù)精確相對分子質(zhì)量、二級碎片離子、質(zhì)譜裂解規(guī)律、mzVault 2.0質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫篩查以及相關(guān)文獻(xiàn)報道，對未知峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。在缺乏對照品的情況下，共鑒定了胃復(fù)春片中164個化學(xué)成分。研究表明，人參皂苷及其代謝產(chǎn)物具有顯著的抗腫瘤作用，尤其是人參經(jīng)蒸制成紅參后，轉(zhuǎn)化的新成分能夠加強抗腫瘤效果[27];香茶菜屬二萜多具有明顯的細(xì)胞毒活性、抑制腫瘤細(xì)胞生長，以及抗炎免疫作用[28];枳殼中的黃酮類成分，尤其是二氫黃酮和多甲氧基黃酮類，具有抗癌、腫瘤，抗微生物、抗炎性反應(yīng)等作用[29]。上述成分構(gòu)成胃復(fù)春片的復(fù)雜體系，通過多通路、多靶點、協(xié)同增效來發(fā)揮健脾益氣、活血解毒之功效。建立的UPLC-Q-Orbitrap法可快速、準(zhǔn)確地對胃復(fù)春片中的主要化學(xué)成分進(jìn)行鑒定分析，從而達(dá)到整體全面地控制與評價中藥復(fù)方的質(zhì)量，為明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015，1174-1175.

[2]陳曦，趙亞紅，張也青，等.胃復(fù)春的臨床應(yīng)用和現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].江西中醫(yī)藥，2016，47（9）：77-80.

[3]鐘靜華.基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的腦得生片和胃復(fù)春片物質(zhì)基礎(chǔ)辨識方法研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2010.

[4]于泓，胡青，孫健，等.基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的黃芪注射液中化學(xué)成分分析[J].世界中醫(yī)藥，2019，14（4）：809-817.

[5]孫戡平，秦昆明，李偉東，等.基于UHPLC-UV-Q-TOF-MS/MS的厚樸不同方法姜制前后化學(xué)成分定性研究[J].世界中醫(yī)藥，2019，14（2）：287-291.

[6]趙思宇.基于化學(xué)分類法探討橘屬植物的物質(zhì)基礎(chǔ)及枳實、枳殼不同抗炎作用[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2018.

[7]劉欣媛，嵇長久，彭文文.中藥枳殼的化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志，2018，53（19）：1627-1631.

[8]趙思宇.枳殼化學(xué)成分的研究[D].長春：吉林大學(xué)，2014.

[9]于國華，楊洪軍，李俊芳，等.基于UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS技術(shù)分析枳實中的化學(xué)成分[J].中國藥學(xué)雜志，2016，41（18）：3371-3378.

[10]馬英華.基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析冬凌草的化學(xué)成分及冬凌草甲素體外代謝研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2017.

[11]馬超一，高文遠(yuǎn)，高穎，等.枳殼化學(xué)成分和代謝成分的UPLC-PAD-Q-TOF/MS分析[J].藥物評價研究，2010，33（2）：110-115.

[12]鄧可眾，丁邑強，周斌，等.枳殼化學(xué)成分的分離與鑒定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（14）：36-38.

[13]何英杰，劉東波，唐其，等.酸橙類中藥材枳實和枳殼化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中藥材，2017，40（6）：1488-1494.

[14]田婷婷.冬凌草甲素大鼠體內(nèi)代謝物的鑒定與藍(lán)萼香茶菜中二萜類質(zhì)量控制方法[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2016.

[15]孫明謙.中藥復(fù)雜成分樣品的電噴霧質(zhì)譜分析方法研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

[16]丁邑強，熊英，周斌，等.枳殼中黃酮類成分的分離與鑒定[J].中國中藥雜志，2015，40（12）：2352-2356.

[17]周大勇，徐青，薛興亞，等.高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法測定枳殼中黃酮苷類化合物[J].分析化學(xué)，2006，34（u09）：31-35.

[18]姚長良.基于化學(xué)表征-數(shù)據(jù)挖掘的三七和相關(guān)制劑的質(zhì)量控制研究[D].上海：中國科學(xué)院上海藥物研究所，2018.

[19]張紅霞，張麗芳，張莉，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時測定胃復(fù)春片中11種成分的含量[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2018，34（12）：1470-1474.

[20]趙靜，秦振嫻，彭冰，等.基于UPLC-Q-TOF MS技術(shù)的三七中皂苷類成分質(zhì)譜裂解規(guī)律研究[J].質(zhì)譜學(xué)報，2017，38（1）：97-108.

[21]蔣慧蓮，祝明，陳勇，等.HPLC法同時測定胃復(fù)春片中藍(lán)萼甲素、藍(lán)萼乙素、藍(lán)萼丁素[J].中成藥，2013，35（1）：86-89.

[22]楊武亮，陳海芳，余寶金，等.枳殼活性化學(xué)成分研究[J].中藥材，2008，31（12）：1812-1815.

[23]孟青，鐘艷梅，郭曉玲，等.人參中皂苷類成分的快速識別及其質(zhì)譜裂解規(guī)律的初步探討[J].中藥材，2013，36（2）：240-245.

[24]邱楠楠，劉金平，蘇航，等.UPLC-ESI-MS-MS分析生曬參和紫紅參中皂苷類成分[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（13）：91-93.

[25]Zhou DY，Xu Q，Xue XY，et al.Identification of O-diglycosyl flavanones in Fructus aurantii by liquid chromatography with electrospray ionization and collision-induced dissociation mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2006，42（4）：441-448.

[26]Zhou DY，Chen DL，Xu Q，et al.Characterization of polymethoxylated flavones in Fructus aurantii by liquid chromatography with atmospheric pressure chemical ionization combined with tandem mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2007，43（5）：1692-1699.

[27]羅林明，石雅寧，姜懿納，等.人參抗腫瘤作用的有效成分及其機(jī)制[J].中草藥，2017，48（3）：582-596.

[28]蘇永慶，湯建，陳海生，等.藍(lán)萼香茶菜萜類和黃酮類化合物的研究新進(jìn)展[J].中國野生植物資源，2017，36（3）：50-77.

[29]陳海芳，張武崗，楊武亮，等.柑橘屬常用中藥黃酮類成分的研究進(jìn)展[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（12）：2863-2865.

（2020-06-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）