基于網絡藥理學探討濕疹溻漬方治療濕疹的作用機制

于鴻妲 陳光耀 閆英

摘要?目的：利用網絡藥理學方法探索濕疹溻漬方（SZTZF）治療濕疹的物質基礎與作用機制。方法：借助TCMSP數據庫篩選每味藥物的有效活性成分和作用靶點，基于GeneCards數據庫篩選與濕疹相關的靶點，確定藥物作用靶點與濕疹疾病靶點的交集基因，并進一步構建濕疹溻漬方有效成分靶點-濕疹疾病靶點的調控網絡;應用STRING平臺構建蛋白相互作用（PPI）網絡模型;同時對二者共同靶點進行GO和KEGG通路分析。結果：共計篩選出49個有效活性成分，對應66個相關的作用靶點，其中有23個靶點與濕疹密切相關。PPI分析結果表明，白細胞介素、簇分化抗原、性激素受體及相關腫瘤蛋白在網絡中占據核心地位。GO功能包括核因子受體活性、轉錄因子活性、類固醇激素受體活性等。KEGG共富集得到6條信號通路，主要為炎性反應、免疫調節、激素抵抗等相關信號通路。結論：濕疹溻漬方中有效活性成分可能通過作IL-6、GASP3、JUN等多個靶點進而調節多條信號通路來起到抑制濕疹炎性反應的作用，研究結果將為進一步研究提供重要信息依據。

關鍵詞?濕疹溻漬方;濕疹;網絡藥理學;作用機制;富集分析;炎性反應;調控網絡;蛋白相互作用

Abstract?Objective：To explore the material basis and mechanism of Shizhen Tazi Decoction（SZTZF）in the treatment of eczema using network pharmacology.Methods：The Platform of Pharmacology Technology of traditional Chinese Medicine system（TCMSP）was used in the screening of the active components and action targets of SZTZF.Correspondingly， the targets related to eczema were screened based on GeneCards database.The intersection genes between drug action targets and eczema disease targets were determined based on the analysis of the two clusters of targets， and the regulatory network of SZTZF′s effective component target-eczema disease target was further constructed.Protein interaction network（PPI）model was constructed with STRING platform.At the same time， the genetic ontology（GO）and the Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）pathway analysis were conducted.Results：Through database analysis，66 targets related to 49 main active components of SZTZF and eczema were selected， of which 23 were closely related to eczema.The results of PPI analysis showed that interleukin， cluster differentiation antigen， sex hormone receptor and related tumor proteins occupy the core position in the network.The genetic ontology（GO）functions of TCM-disease targets included nuclear receptor activity， transcription factor activity， steroid hormone receptor activity and so on.By KEGG enrichment analysis， six signal pathways related to the main components of SZTZF were selected， which were mainly related to inflammation， immune regulation， hormone resistance， etc.Conclusion：The effective active ingredients in SZTZF may act as multiple targets such as IL-6， GASP3， and JUN and then regulate multiple signaling pathways to play a role in inhibiting the inflammatory response of eczema.The research results will provide important information for further research.

Keywords?Shizhen Tazi Decoction; Eczema; Network pharmacology; Mechanism; Enrichment; Inflammatory reaction; Regulatory network analysis; Protein interaction network

中圖分類號：R275.9文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.012

濕疹（Eczema）是一種以皮膚多形損害，有明顯滲出傾向為主要特征的過敏性炎性反應性皮膚病[1]。濕疹皮疹多呈對稱分布，伴劇烈瘙癢，反復發作，易成慢性，嚴重影響生命質量。一項基于我國人群的流行病學研究表明，濕疹在我國一般人群患病率約為7.5%[2-3]。在臨床治療中通常將濕疹分為急性濕疹、亞急性濕疹、慢性濕疹[2]。研究表明，多種因素與濕疹的發生密切相關，包括免疫因素、環境因素、遺傳因素、感染因素、飲食因素等因素有密切關聯[4-5]。在目前臨床中多以抗組胺藥物、抗過敏藥物、糖皮質激素等治療為主，抗組胺藥物、抗過敏藥物往往只能達到緩解癥狀的目的，糖皮質激素雖短期內可迅速控制癥狀，但長期藥物治療后引發多種不良反應，停藥后可能出現皮損惡化，易產生藥物依賴性[6]。研究表明，中醫治療濕疹具有不良反應小，多靶點，多層次，且能夠根據不同證型進行辨證論治，多項臨床研究表明相關中藥內服及外用均有良好的療效。其中，中醫外治法能夠直接作用于皮損部位，不良反應少的特點，在濕疹的治療中具有舉足輕重的地位[7-9]。

濕疹溻漬方（SZTZF）是導師閆英教授經過長期臨床實踐并探索總結的治療濕疹的經驗方，由苦參、荊芥、生地榆等8味藥組成，具有清熱燥濕、祛風止癢、涼血消腫的功效，通過溻漬法作用于皮損處，臨床上治療成人亞急性濕疹以及嬰兒濕疹等有切實療效。前期研究表明，其能夠有效改善瘙癢評分，降低血清中相關白細胞介素及γ-干擾素中細胞因子的表達[10]。同時基于動物研究表明，此方能夠對化學藥物制造的小鼠濕疹模型耳腫脹程度、皮膚病理學及行為學具有良好的改善作用[11]。本文擬通過網絡藥理學方法對濕疹溻漬方中藥物的活性成分、靶蛋白和所涉及的信號通路進行分析，探討濕疹溻漬方治療濕疹的潛在作用機制，為進一步的研究提供基礎。

1?資料與方法

1.1?一般資料?從TCMSP數據庫中獲取濕疹溻漬方中所含8味中藥的化學成分，通GeneCards數據庫獲得濕疹相關的靶點基因，Cytoscape軟件構建有效成分靶點-疾病靶點的網絡模型，通過String數據庫構建蛋白互作網絡，GO與KEGG方法對相關通路進行富集。

1.2?研究方法

1.2.1?濕疹溻漬方（SZTZF）中藥物的活性成分的篩選及匯總?通過中藥系統藥理學數據庫TCMSP[12]與分析平臺數據庫檢索濕疹溻漬方中藥物成分，以生物利用度（OB）≥50%，藥物相似度（DL）≥0.18為篩選標準，篩選其中的有效活性成分。

1.2.2?濕疹疾病的相關靶點及濕疹溻漬方的潛在作用靶點的預測?基于TCMSP平臺提取出的濕疹溻漬方中有效活性成分作用的相關基因靶點，通過GeneCards數據庫獲得濕疹相關的靶點基因，確定濕疹溻漬方中活性成分與濕疹的交集基因。

1.2.3?濕疹溻漬方的調控網絡構建?基于上述分析所得的藥物有效活性成分與疾病相關基因靶點之間的關聯以及靶點預測結果，采用Cytoscape軟件構建濕疹溻漬方有效成分靶點-濕疹疾病靶點的網絡模型，通過該網絡結構揭示濕疹溻漬方治療濕疹的多成分、多靶點、多個相關細胞信號通路的作用特點。

1.2.4?靶點基因蛋白互作網絡構建?將濕疹溻漬方中活性成分對應的基因與濕疹疾病的交集基因基于String數據庫構建蛋白互作網絡，利用該數據庫探索相關基因的文本挖掘、實驗證實、共表達證據及基因融合等證據的蛋白互作關系網絡，并繪制蛋白互作網絡圖，探索疾病與藥物之間的蛋白互作關系，并基于以上數據篩選出核心靶基因。

1.2.5?GO與KEGG富集分析?基于R軟件，使用Bioconductor數據庫，并調用DOSE、clusterProfiler、pathview進行GO和KEGG富集，設置閾值P<0.05，獲取靶基因參與的信號通路。

2?結果

2.1?濕疹溻漬方中藥物有效活性成分篩選匯總?通過TCMSP數據庫檢索獲得濕疹溻漬方中藥物成分，通過篩選（OB）≥50%，（DL）≥0.18得出其有效成分共49種，其中苦參25種、荊芥1種、生地榆1種、白鮮皮4種、防風4種、黃柏6種、馬齒莧1種、蛇床子7種，包括苦參堿、苦參烯堿、芒柄花素、茴香堿、苦參醇、毛癬菌素、槐定堿、白鮮堿、巴馬汀等。具體活性成分的ID、分子式、生物利用度以及類藥性。見表1。

2.2?濕疹溻漬方干預濕疹疾病的潛在作用靶點匯總?本研究通過TCMSP數據庫中共篩選出PTGS1、PTGS2、CHRM3、SCN5A、HTR3A等與濕疹溻漬方藥物活性成分相關的潛在靶點。利用GeneCards數據庫篩選與濕疹密切相關的作用靶點，作者以“eczema”為關鍵詞檢索GeneCards數據庫后獲得了2 391個潛在作用靶點。其中有23個靶點與濕疹溻漬方中藥物活性成分作用靶點重合，最終確定這23個靶點是濕疹溻漬方治療濕疹疾病的候選靶點，包括PTGS2、HTR3A、ADRA1B、ADRB2、OPRM1、IL6、SLC6A4、NOS2、ESR1、AR、MAOB、JUN、IL4、RELA、MMP2、CASP3、MYC、ICAM1、CD44、KDR、PGR、KCNH2、NR3C1。

2.3?濕疹溻漬方的調控網絡構建?本研究利用Cytoscape 3.7.2構建其治療濕疹的調控網絡，見圖1。

2.4?濕疹溻漬方治療濕疹的功能蛋白互作網絡?本研究利用STRING數據庫構建的PPI蛋白互作網絡如下，見圖2。基于各基因連接節點的數目，聯系最為緊密的關鍵基因為IL-6、GASP3、JUN、MYC、PTGS2、IL-4、MMP2、RELA、AR、CD44、ESR1、ICAM1、KDR、NR3C1、PGR等。

2.5?GO功能富集分析?根據圖3可知濕疹溻漬方治療濕疹的效應可能主要是通過干預核因子受體活性、轉錄因子活性、直接配體調控序列特異性DNA結合、類固醇激素受體活性、DNA結合轉錄激活活性等相關基因靶點實現的。

2.6?KEGG功能富集?KEGG功能富集分析可知，濕疹溻漬方主要是通過干預MAPK信號通路、激素抵抗、抗葉酸性、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等多個細胞信號通路起到治療濕疹的作用。見圖4。

3?討論

中醫認為，濕疹由風邪、濕邪、熱邪蘊結于腠理肌表所致，濕熱內蘊耗傷陰血[13]，中醫古籍稱之為“濕瘡”“浸淫瘡”“繡球風”等。《醫宗金鑒·外科心法要訣》中記載濕瘡病的病機“由濕熱內搏，滯于膚腠，外為風乘，不得宣通”。《諸病源候論·瘡候》記載“瘡者，由膚腠虛，風濕之氣，折乎血氣，結聚所生，遞遞相對，如新生茱萸子。痛癢搔抓成瘡，黃汁出，浸淫生長，時搓時劇”。故治以清熱燥濕、祛風止癢、涼血消腫之法。《理瀹駢文》“外治之理即內治之理，外治之藥即內治之藥，所異者法耳”，故中藥的內服和外用治療原則相同[14]。濕疹溻漬方中，苦參和黃柏為君藥，均性味苦寒，苦參有清熱燥濕、殺蟲止癢之功，黃柏清熱燥濕、瀉火解毒，兩者相須為用，加強清熱之力。《本草綱目》記載：“苦參、黃柏之苦寒，皆能補腎，蓋取其苦燥濕、寒除熱也。熱生風，濕生蟲，故又能治風殺蟲”。荊芥、防風、白鮮皮發表祛風、勝濕理血，共為臣藥;生地榆、馬齒莧清熱解毒涼血消腫，蛇床子祛風燥濕殺蟲，共為佐使;全方共奏清熱燥濕、祛風止癢、涼血消腫之效，以上藥物通過外用溻漬法，直達病所。

本研究基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺發現濕疹溻漬方含有苦參堿、苦參烯堿、芒柄花素、茴香堿、苦參醇、毛癬菌素、槐定堿、白鮮堿、巴馬汀等49種有效成分，上述活性成分在文獻中多次相關報道證明其對濕疹有一定的治療作用[15-17]。基于該平臺獲取相關藥物成分的對應靶點基因共66個，并通過Genecards數據庫獲得濕疹相關靶點基因2 391個，兩者共有23個基因靶點相重合，且彼此之間密切關聯。23個重合靶點基因主要與炎性反應、免疫調節、激素抵抗等密切相關。基于PPI網絡對所獲取基因相關表達蛋白關系進行探究，發現白細胞介素、簇分化抗原、性激素受體及相關腫瘤蛋白在網絡中占據核心地位。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫是系統分析基因產物在細胞中的代謝途徑以及這些基因產物功能的數據庫，該數據庫有助于把基因及表達信息作為一個整體的網絡進行研究。對所獲取的23個重合靶點基因進行GO和KEGG富集發現，其效應可能通過干預核因子受體活性、轉錄因子活性、直接配體調控序列特異性DNA結合、類固醇激素受體活性、DNA結合轉錄激活活性等相關基因靶點實現的，與P13K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路、抗葉酸性、激素抵抗信號通路密切相關。

PI3K/AKT信號通路可調控炎性反應細胞的活化、炎性遞質的釋放等途徑，對慢性炎性反應發揮作用[18]。該信號通路不僅與增殖、凋亡密切相關，同時能夠通過調控IκBα的磷酸化、降解，從而激活NF-κB信號通路。NF-κB是一類能與多種基因啟動因子發生特異性結合并促進其轉錄的蛋白質總稱，廣泛參與多種基因特別是免疫炎性反應相關基因的表達調控，影響炎性反應過程。研究表明，NF-κB通路在濕疹患者皮損角質形成細胞中過度被激活[19]。RELA基因所表達蛋白是炎性反應通路NF-κB的關鍵因子，在中性粒細胞的凋亡中有重要地位，活化的中性粒細胞能夠分泌INF-γ、IL-6等炎性因子，升高TNF-α等趨化因子，加重炎性反應[20]。研究表明，TNF-α及IL-6的表達依賴于MAPK信號通路的激活[21]。綜上MAPK信號通路、NF-κB信號通路、P13K-Akt信號通路均為與炎性反應密切相關[22]，濕疹溻漬方可能通過對以上通路的調節作用減輕了濕疹的炎性反應。免疫細胞聚集在炎性反應部位時，處于一個快速缺氧的環境中，進而誘導免疫細胞轉錄HIF-1α，在細胞內積聚后與HIF-1β結合形成HIF-1，HIF-1與HRE結合，參與多條信號轉導通路[23-24]。葉酸可能通過抑制THP-1細胞NF-κB通路的激活及其炎性反應遞質的釋放，進而緩解低氧引起的細胞炎性反應[25]。此外，臨床上部分濕疹患者在規范外用糖皮質激素治療后，皮損面積及癥狀好轉不明顯，存在激素抵抗。濕疹溻漬方可能通過調節激素抵抗相關通路干預此類濕疹患者的治療。綜上所述，這些通路與炎性反應的產生和治療均有一定關聯，同時前期研究表明，濕疹溻漬方能夠抑制血清中相關白細胞介素及γ-干擾素等相關細胞因子的表達，在一定程度上印證了此方對濕疹治療的機制[10-11]。本課題組進將一步通過基礎實驗對濕疹溻漬方治療濕疹網絡藥理學預測相關靶點及通路進行驗證，以闡明該方對濕疹治療的具體機制。

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（2020-03-31收稿?責任編輯：王明）