S100β基因單核苷酸多態性對miRNA靶向調控的影響

楊漪霞，王家豐，李克深，2

1 廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江524000；2 暨南大學華僑醫院

阿爾茨海默病(AD)是癡呆最常見的類型，占所有癡呆的50%～75%，也是目前老年人中最常見的致死原因[1]。AD的神經病理學特征主要是β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經纖維纏結、神經元丟失[2，3]。中樞神經特異蛋白(S100β)是一種鈣結合蛋白，是S100蛋白家族成員之一，在腦組織高度表達，主要存在于神經膠質細胞中，對神經元、神經膠質細胞產生旁分泌和自分泌作用[4]。Barger等[5]研究發現，AD患者腦內淀粉樣斑塊存在S100β異常表達。有研究報道，S100β基因3′非編碼區(3′UTR)多態性與人血清和額葉皮質中較高的S100β含量有關[6，7]。本課題組前期研究亦發現，中國漢族人群S100β基因多態性可能與AD易感性密切相關。這些研究提示S100β可能參與AD的發病過程。微小RNA(miRNA)是一類內源性小分子非編碼RNA，長度為20～24個核苷酸，主要通過與靶mRNA 3′UTR的堿基配對，引起靶mRNA降解或翻譯抑制，從而在轉錄后水平調控蛋白的表達[8]。miRNA在中樞神經系統中含量豐富，其異常表達與一些神經系統疾病的發生、發展密切相關[9]。因此，miRNA可能通過與S100β基因3′UTR堿基配對，從而參與mRNA的轉錄后調控。2019年6月～2020年1月，本研究擬篩選驗證S100β基因3′UTR rs9722位點多態性對miRNA靶向調控效率的影響，旨在為AD的精準醫療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎293T細胞、人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞(以下分別稱293T細胞、SH-SY5Y細胞)，購自美國ATCC細胞庫。miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p，購自廣州銳博生物科技有限公司。S100β-rs9722C、S100β-rs9722T、S100β-rs9722C突變型(S100β-rs9722C-mut)基因型載體，購自上海艾博思生物科技有限公司。熒光定量PCR儀，購自瑞士Roche公司；酶標儀，購自德國Berthold公司；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit、All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit，購自美國GeneCopoeia公司；Dual-LumiTMⅡ雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司。兔抗S100β一抗，美國Cell Signaling Technology公司；鼠抗GAPDH一抗和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗，購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 miRNA與S100β基因靶向調控關系預測 利用TargetScan在線軟件(http：//www.targetscan.org/vert_71/)，根據人S100β基因3′UTR序列，尋找調控S100β基因的miRNA及其配對結合的位點。

1.3 S100β基因rs9722位點不同基因型載體構建 根據S100β基因的序列及3′UTR多態性位點的序列，構建S100β基因rs9722位點的不同基因型載體：S100β-rs9722C、S100β-rs9722T、S100β-rs9722C-mut。PCR產物兩端分別設計ApaI、SaII的酶切位點。S100β基因3′UTR的rs9722C、rs9722T、rs9722C-mut片段擴增產物經雙酶切，并連接至pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體上，然后將連接產物轉化至感受態大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆菌落雙酶切后測序。

1.4 雙熒光素酶活性檢測 取對數生長期293T細胞，接種至24孔板，每孔5×104個，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養。當細胞生長融合60%以上時，按Lipofectamine3000說明，將3′UTR雙熒光素酶質粒(S100β-rs9722C、S100β-rs9722T、S100β-rs9722C-mut)與miRNA模擬物(miRNA mimics、miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p)兩兩組合共轉染293T細胞，分別設為rs9722C+miRNA mimics組、rs9722C+miR-340-3p組、rs9722C+miR-593-3p組、rs9722C+miR-6827-3p組、rs9722T+miRNA mimics組、rs9722T+miR-340-3p組、rs9722T+miR-593-3p組、rs9722T+miR-6827-3p組、rs9722C-mut+miRNA mimics組、rs9722C-mut+miR-340-3p組、rs9722C-mut+miR-593-3p組、rs9722C-mut+miR-6827-3p組。37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養5 h，更換新的完全培養基。培養48 h，收集培養液上清，按Dual-LumiTMⅡ雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.5 細胞轉染 取對數生長期SH-SY5Y細胞，以2×105個/孔接種至6孔板，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養。隨機將細胞分為miRNA NC組、miR-340-3p組、miR-593-3p組、miR-6827-3p組，當細胞生長融合70%以上時，按Lipofectamine3000說明，分別加入miRNA mimics、miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p轉染，然后置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱培養72 h。

1.6 miRNA表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集上述各組轉染72 h細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續實驗。按All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit說明，將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄條件：37 ℃ 60 min， 85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按照All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit說明進行PCR擴增。引物序列：hsa-miR-340-3p上游引物5′-ATGGTTCGTGGGTCCGTCTCAG-3′，hsa-miR-593-3p上游引物5′-ATGGTTCGTGGGTGTCTCTGC-3′，hsa-miR-6827-3p上游引物5′-ATGGTTCGTGGGACCGTCTCTTC-3′，miRNA通用下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應體系共20 μL：2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O補足至20 μL；反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40個循環。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.7 S100β表達檢測 采用Western blotting法。收集上述各組轉染72 h細胞，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，經BCA法蛋白定量合格后，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白60 μg，SDS-PAGE分離蛋白。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗S100β一抗(稀釋比1∶500)、鼠抗GAPDH一抗(稀釋比1∶5 000)，4 ℃孵育過夜；次日，分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶1 000)、山羊抗鼠IgG二抗(稀釋比1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，ECL發光，暗室中曝光、顯影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 miRNA與S100β基因的靶向調控關系 TargetScan在線軟件預測發現，miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p與S100β基因3′UTR存在結合位點，miR-340-3p、miR-6827-3p的5′-CUCUGCC-3′序列與S100β基因3′UTR的5′-GAGACGG-3′序列完全互補，而miR-593-3p的5′-GUCUCUG-3′序列與S100β基因3′UTR的5′-CAGAGAC-3′序列完全互補。見圖1。

圖1 miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p與S100β基因3′UTR的互補序列示意圖

2.2 S100β基因rs9722位點不同基因型載體鑒定 S100β基因rs9722位點S100β-rs9722C、S100β-rs9722T、S100β-rs9722C-mut序列見圖2。經鑒定，3種序列的雙酶切片段大小和目的基因序列片段大小一致，見圖3。

注：lane1空白質粒、lane2雙酶切后產物。

圖2 構建的S100β基因rs9722位點各基因型載體示意圖

2.3 各組雙熒光素酶活性比較 rs9722C+miRNA mimics組、rs9722C+miR-340-3p組、rs9722C+miR-593-3p組、rs9722C+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性分別為184.70±2.96、131.40±19.57、163.00±14.75、123.10±10.02；rs9722C+miR-340-3p組、rs9722C+miR-593-3p組、rs9722C+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性均低于rs9722C+miRNA mimics組(P均<0.05)。rs9722T+miRNA mimics組、rs9722T+miR-340-3p組、rs9722T+miR-593-3p組、rs9722T+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性分別為153.70±14.29、140.80±35.84、178.80±8.93、151.90±18.33；rs9722T+miR-340-3p組、rs9722T+miR-593-3p組、rs9722T+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性與rs9722T+miRNA mimics組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。rs9722C-mut+miRNA mimics組、rs9722C-mut+miR-340-3p組、rs9722C-mut+miR-593-3p組、rs9722C-mut+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性分別為166.80±23.92、191.10±10.05、191.20±7.24、181.50±6.55；rs9722C-mut+miR-340-3p組、rs9722C-mut+miR-593-3p組、rs9722C-mut+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性與rs9722C-mut+miRNA mimics組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

2.4 各組轉染后相應miRNA表達比較 miR-340-3p組及其對照miRNA NC組miR-340-3p相對表達量分別為23.94±0.80、1.00±0.02，miR-593-3p組及其對照miRNA NC組miR-593-3p相對表達量分別為39.27±1.50、1.04±0.07，miR-6827-3p組及其對照miRNA NC組miR-6827-3p相對表達量分別為205.10±15.87、1.01±0.01。miR-340-3p組、miR-593-3p組、miR-6827-3p組相應miRNA相對表達量均高于其對照miRNA NC組(P均<0.05)。

2.5 各組轉染后S100β表達比較 miR-340-3p組及其對照miRNA NC組S100β相對表達量分別為0.45±0.10、0.59±0.05，miR-593-3p組及其對照miRNA NC組S100β相對表達量分別為0.33±0.10、0.42±0.19，miR-6827-3p組及其對照miRNA NC組S100β相對表達量分別為0.11±0.01、0.48±0.12。miR-6827-3p組S100β相對表達量低于其對照miRNA NC組(P<0.05)，而miR-340-3p組、miR-593-3p組S100β相對表達量與其對照miRNA NC組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

3 討論

AD是癡呆最常見的類型，但迄今為止其發病機制仍未完全清楚。目前，AD的發病機制主要有Aβ蛋白沉積學說、Tau蛋白異常磷酸化學說、氧化應激學說等[10]。越來越多證據表明，S100蛋白家族能夠參與AD的發病。在炎癥性疾病和神經退行性疾病中S100β表達增加。S100β在納摩爾濃度時可刺激神經軸突生長、增強神經元生存能力，而在微摩爾濃度時則可增加促炎癥細胞因子表達，促進神經元凋亡[11]。Mori等[12]研究發現，過表達S100β能夠加重Tg2576轉基因AD小鼠腦實質和腦血管淀粉樣蛋白沉積，促進淀粉樣前體蛋白加工，從而影響Aβ表達。Lambert等[13]在3個獨立人群中發現，S100β基因rs2300403位點單核苷酸多態性與認知功能下降有關；他們在6個獨立人群，特別是婦女和老年人群中，發現這個位點單核苷酸多態性與AD的發生風險增加有關。S100β的這種遺傳變異增加了罹患AD的風險，可能參與從輕度認知功能下降到顯性癡呆的連續過程。因此推測，對S100β基因的調控有可能影響AD的發生、發展。

miRNA是廣泛存在于真核生物體內的一類內源性小分子非編碼RNA，能夠參與基因轉錄后水平的調控。miRNA在中樞神經系統中特異性表達，能夠參與神經系統生長發育和生理功能，如胚胎神經發育、神經干細胞增殖與分化、突觸可塑性等[14，15]。有研究報道，miRNA在AD的發病過程中具有重要的調控作用，如改變淀粉樣前體蛋白產生或清除、影響Tau蛋白異常磷酸化、影響突觸可塑性和受體功能障礙等[16]。在AD模型SAMP8小鼠海馬組織中miR-340表達下調，而β淀粉樣前體蛋白裂解酶1(BACE1)表達上調；過表達miR-340可降低SH-SY5Y/APPswe細胞BACE1表達[17]。提示AD模型SAMP8小鼠腦組織miR-340表達與BACE1表達可能呈負相關關系，miR-340可能通過靶向調控BACE1表達進而減少Aβ沉積。但miR-593、miR-6827與神經退行性疾病的關系鮮有報道。

本研究通過TargetScan在線軟件預測發現，miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p與S100β基因rs9722位點的3′UTR存在結合位點，提示這3個miRNA對S100β基因rs9722位點可能存在靶向調控作用。通過構建S100β基因rs9722位點不同基因型載體(S100β-rs9722C、S100β-rs9722T、S100β-rs9722C-mut)，經鑒定，其雙酶切片段大小與目的基因序列片段大小一致。進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗顯示，rs9722C+miR-340-3p組、rs9722C+miR-593-3p組、rs9722C+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性均低于rs9722C+miRNA mimics組；rs9722T+miR-340-3p組、rs9722T+miR-593-3p組、rs9722T+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性與rs9722T+miRNA mimics組比較差異均無統計學意義；rs9722C-mut+miR-340-3p組、rs9722C-mut+miR-593-3p組、rs9722C-mut+miR-6827-3p組雙熒光素酶活性與rs9722C-mut+miRNA mimics組比較差異均無統計學意義。這提示miR-340-3p、miR-6827-3p能夠靶向調控S100β基因rs9722位點的3′UTR，但其調控效率可能存在基因型差異。為了驗證miRNA對S100β基因的靶向調控作用，本研究將miRNA NC、miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p轉染SH-SY5Y細胞，發現miR-340-3p組、miR-593-3p組、miR-6827-3p組相應miRNA相對表達量均高于其對照miRNA NC組，提示miR-340-3p、miR-593-3p、miR-6827-3p均轉染成功。進一步觀察各組轉染后S100β表達發現，miR-6827-3p組S100β相對表達量低于其對照miRNA NC組，而miR-340-3p組、miR-593-3p組S100β相對表達量與其對照miRNA NC組比較差異均無統計學意義。提示miR-6827-3p可靶向調控S100β基因rs9722C的3′UTR，對S100β基因具有一定的調控能力。

綜上所述，miRNA對S100β基因轉錄后調控效率可能存在基因型差異，miR-6827-3p可能通過靶向結合S100β基因rs9722C基因型mRNA，從而調控S100β表達，進而影響AD的易感性。