三陰乳腺癌組織Ki-67、miR-155、MUC1表達(dá)變化及其臨床意義

王延濤，陳偉娜

青島市第八人民醫(yī)院，山東青島266100

三陰乳腺癌(TNBC)是乳腺癌的一種特殊亞型，占所有乳腺癌的15%～20%。與其他類型乳腺癌相比，TNBC具有侵襲性強(qiáng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高和預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原Ki-67是在增殖細(xì)胞中表達(dá)的一種核抗原，與細(xì)胞有絲分裂有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67表達(dá)變化與多種腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。王仙玲[3]研究發(fā)現(xiàn)，在TNBC組織中Ki-67高表達(dá)，而Ki-67低表達(dá)是TNBC患者無病生存期延長(zhǎng)的保護(hù)性因素。微小RNA-155(miR-155)是miRNA家族成員之一。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在乳腺癌診斷和預(yù)后評(píng)估中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[4]。段衛(wèi)明等[5]認(rèn)為，miR-155可作為預(yù)測(cè)TNBC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物。黏蛋白1(MUC1)是分布于機(jī)體正常黏膜表面的高分子量糖蛋白，其分子由肽核心和糖鏈組成，對(duì)正常上皮組織具有潤(rùn)滑和保護(hù)作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，MUC1是一種重要的腫瘤相關(guān)抗原，與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和遷移有關(guān)[6，7]。但目前Ki-67、miR-155、MUC1表達(dá)與TNBC發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的報(bào)道相對(duì)較少。為此，本研究觀察了TNBC組織Ki-67、miR-155、MUC1表達(dá)變化，并探討其臨床意義。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1～12月青島市第八人民醫(yī)院收治的TNBC患者85例。所有患者經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查明確乳腺癌診斷[8]，免疫組化染色提示雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)均陰性，符合TNBC。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合TNBC診斷；②初診，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②男性；③有家族遺傳性疾病者。患者年齡38～64(51.23±6.47)歲，其中<50歲42例、≥50歲43例；絕經(jīng)38例，未絕經(jīng)47例；組織分化程度：低分化16例，中分化18例，高分化51例；腫瘤直徑：≤2 cm 27例，>2 cm 58例；臨床分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期27例，Ⅲ期34例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。本研究經(jīng)青島市第八人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 Ki-67、MUC1表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取手術(shù)切除的TNBC組織及其配對(duì)的癌旁正常組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。切片經(jīng)70 ℃烘箱烤片2 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液中高溫高壓修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫。正常山羊血清工作液封閉，然后滴加鼠抗人Ki-67、MUC1單克隆抗體，37 ℃孵育2 h，滴加生物素標(biāo)記的羊抗人IgG二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。以羊抗人IgG代替一抗作為陰性對(duì)照，已知Ki-67、MUC1陽性標(biāo)本作為陽性對(duì)照。

采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片。Ki-67陽性染色定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒；MUC1陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，評(píng)估每視野染色強(qiáng)度；每視野計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞比例。染色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞比例評(píng)分：<5%為0分，5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，≥75%為4分。以染色強(qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞比例評(píng)分綜合評(píng)定陽性表達(dá)，二者乘積>4為陽性表達(dá)。

1.3 miR-155表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。取手術(shù)切除的TNBC組織及其配對(duì)的癌旁正常組織，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA純度和濃度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。以cDNA為模板，按2×SYBR Green qPCR Mix說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-155上游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG-3′，下游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGAT-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA-3′，下游引物5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×SYBRGreen qPCR Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，RNase Free H2O 8.2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 10 s共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 TNBC組織與癌旁正常組織Ki-67、miR-155、MUC1表達(dá)比較 TNBC組織與癌旁正常組織Ki-67陽性表達(dá)率分別為80.00%(68/85)、56.47%(48/85)，miR-155相對(duì)表達(dá)量分別為1.32±0.17、0.76±0.23，MUC1陽性表達(dá)率分別為77.65%(66/85)、62.35%(53/85)。TNBC組織Ki-67、MUC1陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織(χ2分別為10.856、4.734，P均<0.05)，miR-155相對(duì)表達(dá)量亦高于癌旁正常組織(t=18.052，P<0.05)。

2.2 TNBC組織Ki-67、miR-155、MUC1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 TNBC組織Ki-67、miR-155、MUC1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 TNBC組織Ki-67、miR-155、MUC1表達(dá)的關(guān)系 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，TNBC組織Ki-67表達(dá)與miR-155、MUC1表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.713、0.647，P均<0.05)，miR-155表達(dá)與MUC1表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.596，P<0.05)。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，約占女性惡性腫瘤的30%，已成為威脅女性健康的主要病因。TNBC是乳腺癌的一種特殊亞型，占所有乳腺癌的15%～20%。與其他類型乳腺癌相比，TNBC具有侵襲性強(qiáng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高和預(yù)后差等特點(diǎn)。由于TNBC的激素受體和HER-2受體均陰性，無內(nèi)分泌治療和抗HER-2受體靶向治療指征，聯(lián)合化療成為其內(nèi)科治療的主要手段，但常規(guī)化療往往效果不佳，而化療效果不佳的TNBC患者2年內(nèi)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高，預(yù)后和生存狀況較差。因此，尋找TNBC新的治療靶點(diǎn)成為近年研究的熱點(diǎn)。

Ki-67是一種非組蛋白性核蛋白，存在于具有增殖活性的細(xì)胞核中，與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān)，是反映細(xì)胞群體增殖活性的良好指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67表達(dá)變化與多種腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]；Ki-67表達(dá)越高，腫瘤惡性程度越高，越容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[9，10]。邢芳林等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TNBC患者Ki-67陽性指數(shù)明顯高于非TNBC患者，推測(cè)Ki-67可作為預(yù)測(cè)腫瘤生物學(xué)行為和判斷患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNBC組織Ki-67陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織；TNBC組織Ki-67陽性表達(dá)與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑和組織分化程度無關(guān)。提示TNBC組織Ki-67高表達(dá)，其表達(dá)變化與TNBC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

miRNA是一類短序列、非編碼單鏈小分子RNA，其轉(zhuǎn)錄后能夠參與基因表達(dá)的調(diào)控，從而影響生物體內(nèi)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程。miR-155作為miRNA家族成員之一，基因定位于染色體21q21，在甲狀腺癌、胰腺癌、肺癌等惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，被認(rèn)為是一種癌性miRNA[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-155能夠改變?nèi)巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)，參與乳腺癌的惡性轉(zhuǎn)化[13]。Kia等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可通過抑制性別決定區(qū)Y框蛋白表達(dá)促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNBC組織miR-155相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織；TNBC組織miR-155表達(dá)與腫瘤組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑和臨床分期無關(guān)，與謝小紅等[15]研究結(jié)果一致。提示TNBC組織miR-155表達(dá)升高，其表達(dá)變化與TNBC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

MUC1為異源二聚體跨膜糖蛋白，編碼基因定位于染色體1q21，含有7個(gè)外顯子。正常情況下，MUC1主要表達(dá)于組織、器官上皮細(xì)胞近管腔或腺腔面，如胃腸道、泌尿生殖道、乳腺等，呈極性分布，具有潤(rùn)滑和保護(hù)上皮組織作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，MUC1還能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互黏附，從而參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，在多種上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤中異常表達(dá)[16]。Sun等[17]研究報(bào)道，90%以上的乳腺癌組織MUC1過表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，TNBC組織MUC1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，進(jìn)一步證實(shí)TNBC組織MUC1高表達(dá)。孟迪等[18]研究表明，MUC1在TNBC組織中不存在表達(dá)優(yōu)勢(shì)，且與患者預(yù)后相關(guān)的臨床病理特征無關(guān)，如臨床分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNBC組織MUC1表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、組織分化程度、腫瘤直徑、臨床分期無關(guān)，與孟迪等[18]報(bào)道并不一致。有研究認(rèn)為，當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)MUC1的極性分布被破壞，細(xì)胞表面分子間的黏附作用降低，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移[19]。因此，TNBC組織MUC1表達(dá)變化與TNBC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，TNBC組織Ki-67表達(dá)與miR-155、MUC1表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系，miR-155表達(dá)與MUC1表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系，提示Ki-67、miR-155、MUC1共同參與了TNBC的發(fā)生、發(fā)展。但目前三者在TNBC中相互作用的機(jī)制尚不清楚，還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，TNBC組織Ki-67、miR-155、MUC1表達(dá)明顯升高，三者可能共同參與TNBC的發(fā)生、發(fā)展。由于本研究未觀察TNBC組織與其他類型乳腺癌組織Ki-67、miR-155、MUC1表達(dá)變化，Ki-67、miR-155、MUC1能否作為TNBC診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物尚不清楚，還需今后進(jìn)一步研究。