依托考昔對(duì)大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響

王一寒，張?jiān)戚x，李亙，張超，董宇啟

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院南院，上海201112；2 上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院3 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加和易發(fā)生骨折為特征的全身性疾病，是絕經(jīng)后婦女的常見(jiàn)病、多發(fā)病。骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的后果，能夠使患者日常生活活動(dòng)和自理能力下降，甚至喪失獨(dú)立生活能力[1，2]。據(jù)報(bào)道，2010年我國(guó)發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折患者約233萬(wàn)例，至2050年，骨質(zhì)疏松性骨折患者將達(dá)到599萬(wàn)例[3]。因此，骨質(zhì)疏松性骨折不僅是一個(gè)公共健康問(wèn)題，還是一個(gè)重要的社會(huì)問(wèn)題。COX-2抑制劑是骨折圍手術(shù)期鎮(zhèn)痛的常用藥物。有研究報(bào)道，COX-2抑制劑能夠使骨折愈合延遲[4，5]。但也有研究認(rèn)為，COX-2抑制劑并不影響骨折愈合[6，7]。依托考昔是一種高選擇性COX-2抑制劑，用于骨科圍手術(shù)期具有良好的鎮(zhèn)痛效果[8]，其對(duì)骨折愈合影響的研究結(jié)論不盡相同[9，10]，但鮮見(jiàn)其對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折愈合影響的報(bào)道。為此，2014年3月～2015年4月，本研究建立了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型，并觀(guān)察了依托考昔對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠36只，清潔級(jí)，7月齡，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(滬)2014-0029。獨(dú)立通風(fēng)籠具飼養(yǎng)，每籠4只。飼養(yǎng)條件：溫度(25±3)℃，濕度(40±3)%，光照12 h明暗交替，自由攝食、飲水。依托考昔，購(gòu)自杭州默沙東制藥有限公司。萬(wàn)能材料力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)，購(gòu)自日本島津株式會(huì)社；熒光倒置顯微鏡，購(gòu)自日本尼康株式會(huì)社。

1.2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折模型構(gòu)建 所有SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，進(jìn)食、飲水自如，活動(dòng)正常，無(wú)脫毛、斷尾、死亡等現(xiàn)象，逐一稱(chēng)量體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉滿(mǎn)意后，經(jīng)腹正中切口行雙側(cè)卵巢去勢(shì)手術(shù)[11]；常規(guī)飼養(yǎng)3個(gè)月后，再次逐一稱(chēng)量體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，麻醉滿(mǎn)意后，按文獻(xiàn)[12]方法，于股骨中段做一約2 cm縱行切口，逐層剝離，充分暴露股骨，使用擺動(dòng)鋸片配合骨刀造成橫行骨折，然后用1.2 mm克氏針順行髓內(nèi)固定，確定骨折端固定穩(wěn)定和髖、膝關(guān)節(jié)活動(dòng)不受限，關(guān)閉切口。

1.3 動(dòng)物分組與藥物干預(yù) 所有大鼠內(nèi)固定術(shù)后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，進(jìn)食、飲水自如，無(wú)脫毛、斷尾、死亡等現(xiàn)象，將大鼠隨機(jī)分為長(zhǎng)期用藥組、短期用藥組、對(duì)照組，每組12只。依托考昔應(yīng)用于人骨折圍手術(shù)期鎮(zhèn)痛的常用劑量為60 mg/d[13]，將依托考昔(每片60 mg)研磨成粉末，用生理鹽水配制成1.1 mg/mL溶液，根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》按人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量，設(shè)定給藥劑量。長(zhǎng)期用藥組每天依托考昔溶液5.4 mg/kg灌胃1次，連續(xù)6周；短期用藥組每天依托考昔溶液5.4 mg/kg灌胃1次，連續(xù)灌胃1周后，等容量生理鹽水連續(xù)灌胃5周；對(duì)照組每天等容量生理鹽水連續(xù)灌胃6周。

1.4 組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察 內(nèi)固定術(shù)后1、2、4周，各組隨機(jī)取3只，斷頸處死，取雙側(cè)股骨骨折端骨痂組織，-80 ℃保存。待組織成批后，10%中性甲醛固定48 h，100 g/L EDTA-2Na(pH=7.2)脫鈣，每周更換1次，直至脫鈣滿(mǎn)意。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，縱向石蠟包埋，4 μm厚切片，常規(guī)HE染色，中性樹(shù)膠封固，熒光倒置顯微鏡下拍照。

1.5 生物力學(xué)檢測(cè) 內(nèi)固定術(shù)后6周，斷頸處死剩余大鼠，取出雙側(cè)股骨，去除克氏針，利用萬(wàn)能材料力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)，采用三點(diǎn)彎曲法檢測(cè)股骨骨折愈合處最大載荷和彈性載荷。

2 結(jié)果

2.1 各組股骨骨折端骨痂組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察 內(nèi)固定術(shù)后1周，對(duì)照組可見(jiàn)豐富的纖維組織且排列整齊，并可見(jiàn)散在軟骨骨痂形成，而短期用藥組和長(zhǎng)期用藥組可見(jiàn)大量纖維組織，但密度較低且分布不均勻。內(nèi)固定術(shù)后2周，對(duì)照組骨小梁開(kāi)始形成，軟骨骨痂大量增生；短期用藥組可見(jiàn)骨小梁形成且連續(xù)，但密度分布不均勻，軟骨細(xì)胞增多；長(zhǎng)期用藥組以纖維骨痂為主，可見(jiàn)散在骨小梁，連續(xù)性差，軟骨骨痂稀疏。內(nèi)固定術(shù)后4周，對(duì)照組可見(jiàn)大量排列整齊的骨小梁，基本完成軟骨骨痂的骨轉(zhuǎn)化過(guò)程；短期用藥組骨小梁表現(xiàn)接近對(duì)照組，長(zhǎng)期用藥組骨小梁粗細(xì)不均且排列紊亂，間隙較寬，可見(jiàn)大量軟骨骨痂。

2.2 各組股骨骨折愈合處最大載荷、彈性載荷比較 長(zhǎng)期用藥組有1只體型消瘦、毛發(fā)稀疏、活動(dòng)減弱，對(duì)照組有1只左側(cè)大腿發(fā)生感染腫脹，均剔除實(shí)驗(yàn)，再次造模補(bǔ)充。各組股骨骨折愈合處最大載荷、彈性載荷比較見(jiàn)表1。

表1 各組股骨骨折愈合處最大載荷、彈性載荷比較

3 討論

隨著人口老齡化加劇，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥的患病率明顯增加。目前，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥患者約有9 000萬(wàn)，至2050年將達(dá)到2億。骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重的后果，患者往往伴隨疼痛、抑郁、活動(dòng)恐懼等，具有較高的致殘率和致死率[14，15]。骨質(zhì)疏松性骨折多發(fā)生于絕經(jīng)后婦女，并且骨折愈合時(shí)間較長(zhǎng)，骨不連風(fēng)險(xiǎn)較高。因此，探索絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松性骨折的相關(guān)治療具有重要意義。

COX-2抑制劑能夠通過(guò)選擇性抑制COX-2表達(dá)來(lái)抑制前列腺素合成，從而達(dá)到抗炎、鎮(zhèn)痛等作用，其胃腸道不良反應(yīng)較傳統(tǒng)非甾體抗炎藥明顯減少，是骨科圍手術(shù)期鎮(zhèn)痛的常用藥物[16]。依托考昔是一種高選擇性COX-2抑制劑，2002年首先在英國(guó)上市，2008年在中國(guó)正式上市。國(guó)內(nèi)最早用依托考昔治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、滑囊炎等，近年開(kāi)始用于骨科圍手術(shù)期鎮(zhèn)痛治療[8]，具有較好的鎮(zhèn)痛效果且鮮有胃腸道不良反應(yīng)[17]。Moreschi等[9]研究表明，依托考昔能夠延遲新西蘭雄兔自體顱骨的愈合過(guò)程，但對(duì)最終移植骨愈合無(wú)明顯影響；陳海濤等[10]研究發(fā)現(xiàn)，依托考昔能夠抑制新西蘭兔橈骨骨折的愈合過(guò)程。但國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)依托考昔對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折愈合影響的報(bào)道。

本研究通過(guò)雙側(cè)卵巢去勢(shì)手術(shù)建立大鼠骨質(zhì)疏松癥模型，該模型能夠模擬絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的病理過(guò)程，其病理生理特征與人類(lèi)接近[18]，然后按照Xu等[12]方法制備股骨骨折模型，并觀(guān)察依托考昔治療不同時(shí)間股骨骨折端骨痂組織形態(tài)學(xué)變化和骨折愈合處最大載荷、彈性載荷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)固定術(shù)后1周，對(duì)照組可見(jiàn)豐富的纖維組織且排列整齊，并可見(jiàn)散在軟骨骨痂形成，而短期用藥組和長(zhǎng)期用藥組可見(jiàn)大量纖維組織，但密度較低且分布不均勻，提示內(nèi)固定術(shù)后1周內(nèi)依托考昔對(duì)纖維組織生成的抑制作用不明顯，對(duì)軟骨骨痂生成的抑制作用明顯。內(nèi)固定術(shù)后2周，對(duì)照組骨小梁開(kāi)始形成，軟骨骨痂大量生成；短期用藥組可見(jiàn)骨小梁形成且連續(xù)，但密度分布不均勻，軟骨細(xì)胞增多；長(zhǎng)期用藥組以纖維骨痂為主，可見(jiàn)散在的骨小梁，連續(xù)性差，軟骨骨痂稀疏，提示連續(xù)應(yīng)用依托考昔2周能夠明顯抑制骨質(zhì)疏松性骨折愈合。內(nèi)固定術(shù)后4周，對(duì)照組可見(jiàn)大量排列整齊的骨小梁，基本完成軟骨骨痂的骨轉(zhuǎn)化過(guò)程，短期用藥組骨小梁表現(xiàn)接近對(duì)照組，長(zhǎng)期用藥組骨小梁粗細(xì)不均勻且排列紊亂，間隙較寬，可見(jiàn)大量軟骨骨痂，提示連續(xù)應(yīng)用依托考昔4周能夠抑制骨性愈合速度和質(zhì)量，延長(zhǎng)愈合時(shí)間，但其抑制骨折愈合的作用是可逆的，早期停藥后骨折愈合可恢復(fù)到正常水平。骨生物力學(xué)特征是評(píng)價(jià)骨折愈合程度的重要依據(jù)。本研究通過(guò)萬(wàn)能材料力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)，采用三點(diǎn)彎曲法檢測(cè)股骨骨折愈合處最大載荷和彈性載荷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)固定術(shù)后6周，長(zhǎng)期用藥組股骨骨折愈合處最大載荷、彈性載荷均低于對(duì)照組和短期用藥組，而對(duì)照組與短期用藥組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示依托考昔能夠降低骨質(zhì)疏松性骨折的骨性愈合強(qiáng)度，而早期停藥對(duì)骨性愈合強(qiáng)度的影響不大。

綜上所述，長(zhǎng)期應(yīng)用依托考昔能夠延遲和抑制大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折愈合，并能使骨折愈合強(qiáng)度降低，而短期應(yīng)用對(duì)骨折愈合的影響不大。