高效液相色譜法同時測定蛇莓提取物中4種成分的含量

耿麗，李聰，李志浩

(湖北醫藥學院附屬東風醫院藥學部，十堰 442000)

蛇莓為薔薇科植物蛇莓[Duchesneaindica(Andr.)Focke]的全草，味甘、苦，性寒，具清熱解毒、涼血止血、散瘀消腫之功效，常用于熱病、驚癇、感冒、痢疾、黃疸、目赤、口瘡、咽痛、疔腫、毒蛇咬傷、吐血、崩漏、月經不調、跌打腫痛等治療[1]。蛇莓始載于《名醫別錄》，而《本草綱目》則對其主要特征和生長環境進行了詳盡描述：“蛇莓，就地引細蔓，節節生根，每枝三葉，葉有齒刻，四、五月開小黃花……當是取其莖葉并根也”。鑒于其上述主要特征，故蛇莓又名三爪龍、雞冠果、龍吐珠、落地楊梅、血疔草及蛇皮藤等。據研究報道[2-3]，蛇莓中主要含有黃酮類、酚酸類、萜類、鞣酸花類及甾醇類等化合物。現代藥理研究表明，蛇莓具有抗腫瘤[4]、降血糖及防治老年癡呆[5]、抗病毒[6]、抗氧化應激[7]、抗菌及調節免疫[8]等藥理作用。本實驗基于前期蛇莓物質基礎的研究，擬以蛇莓提取物中香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚為檢測指標，筆者參考文獻[9-14]，采用高效液相色譜(HPLC)法，應用梯度洗脫，對提取物中的上述4種成分進行含量測定，為蛇莓相關功能性產品的深入開發提提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters高效液相色譜儀系統[沃特世科技(上海)有限公司]，EYELA旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社)，Eppendorf 微量移液器(德國艾本德股份公司)，MJ超聲清洗機(無錫市美極超聲設備有限公司)。

1.2試藥 香草酸對照品(批號：110776-201503)、異槲皮苷對照品(批號：111809-201804)、染料木素對照品(批號：111704-201703)及山柰酚對照品(批號：110861-201611)，均購自中國食品藥品檢定研究院。蛇莓購自安徽亳州藥材市場(產地：四川瀘州)，經湖北醫藥學院陳吉炎教授鑒定為薔薇科植物蛇莓[Duchesneaindica(Andr.)Focke]的全草。蛇莓提取物(自制，批號：20180910，20180918，20180927)，乙腈(色譜級，德國默克)，純化水(自制)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：Kromasiol-100 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相組成：乙腈(A)-0.05%磷酸(B)進行梯度洗脫：0～10 min，10%→42%A；10～16 min，42%→60%A；16～30 min，60%→80%A；30～35 min，80%→90%A；流速：1 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：350 nm。

2.2蛇莓提取物制備 稱取經烘干并粉碎過20目篩的蛇莓藥材適量，加15倍量純化水回流提取1次，而后加12倍量純化水回流提取2次，抽濾，合并3次的蛇莓提取液，減壓濃縮至相對密度為1.50，溫度為90 ℃，濃縮液加95%乙醇以達50%含醇量，充分攪拌后靜置15 h，取上清液減壓濃縮。濃縮液經D101大孔吸附樹脂充分吸附。為有效去除水溶性雜質、無機鹽等，先用純化水洗脫3個柱體積(3 BV)，而后采用25%乙醇洗脫2 BV，用65%乙醇洗脫5 BV，收集合并65%乙醇洗脫液，經減壓濃縮并真空干燥，經雙層封口袋和干燥器存放，待用。

2.3樣品的制備

2.3.1對照品溶液的制備 稱取干燥至恒質量的香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚對照品適量于量瓶中，精密稱定，用乙腈溶解并定容，制得分別含香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚為123.8，282.4，153.2 和203.7 μg·mL-1的對照品溶液，備用。

2.3.2供試品溶液的制備 稱取蛇莓提取物50 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，先用2 mL的65%乙醇溶解，而后乙腈定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4方法專屬性 按上述色譜條件HPLC進樣分析，得到對照品和蛇莓提取物的HPLC色譜圖，見圖1。結果顯示香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚的分離度良好，特異性高。

A.對照品；B.蛇莓提取物；1.香草酸；2.異槲皮苷；3.染料木素；4.山柰酚。

2.5線性關系考察 精密吸取“2.3.1”項所制的對照品溶液適量于10 mL量瓶中，加乙腈分別制成香草酸濃度為3.095，6.19，12.38，30.95，61.9，123.8 μg·mL-1、異槲皮苷濃度為7.06，14.12，28.24，70.6，141.2，282.4 μg·mL-1、染料木素濃度為3.83，7.66，15.32，38.3，76.6，153.2 μg·mL-1、山柰酚濃度為5.092 5，10.185，20.37，50.925，101.85，203.7 μg·mL-1系列對照品溶液。按上述色譜條件HPLC進樣分析，記錄峰面積，以峰面積(Y)對對照品溶液濃度(X)進行線性回歸，香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚分別在3.095～123.8，7.06～282.4，3.83～153.2和5.092 5～203.7 μg·mL-1范圍內線性關系良好，其回歸方程分別為Y=5.831 2×105X+427.3(r=0.999 9)、Y=1.135 9×106X-372.5(r=0.999 8)、Y=6.625 8×105X-418.9(r=0.999 7)、Y=9.295 1×105X+429.5(r=0.999 9)。

2.6精密度實驗 精密吸取含香草酸30.95 μg·mL-1、異槲皮苷70.6 μg·mL-1、染料木素38.3 μg·mL-1、山柰酚50.925 μg·mL-1的混合對照品溶液連續進樣6針，記錄峰面積，結果顯示香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚峰面積RSD分別為1.42%，1.05%，1.26%及1.13%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.7重復性實驗 稱取蛇莓提取物(批號：20180910)6份，每份50 mg，精密稱定，按“2.3.2”項制備供試品溶液，經孔徑0.45 μm濾膜濾過后HPLC分析，記錄香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚峰面積并計算提取物中各成分的含量。結果顯示蛇莓提取物中的香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚的含量分別為5.826，17.512，8.974和10.739 mg·g-1，各成分峰面積RSD分別為1.37%，1.21%，1.44%及1.16%，均小于2%，表明方法重復性良好。

2.8穩定性實驗 按“2.3.2”項下制備供試品溶液，經孔徑0.45 μm濾膜濾過后，分別在0，1，2，3，6，9，12，24，48 h經HPLC分析測定，記錄香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚4種成分的峰面積，結果上述4種成分峰面積RSD分別為1.29%，1.43%，1.18%及1.35%，均小于2%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.9加樣回收率實驗 稱取已知含量的蛇莓提取物(批號：20180910)6份，每份25 mg，精密稱定，加入65%乙醇2 mL溶解，再加入3 mL含香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚分別為61.9，141.2，76.6及101.85 μg·mL-1的對照品溶液，于10 mL量瓶中乙腈定容，經孔徑0.45 μm濾膜濾過后HPLC分析，計算加樣回收率及RSD，結果見表1。

表1 4種成分加樣回收率結果

2.10樣品測定 稱取批號為20180910，20180918，20180927的蛇莓提取物各50 mg，精密稱定，制備供試品溶液，經孔徑0.45 μm濾膜濾過后HPLC分析，記錄峰面積并計算蛇莓提取物中香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚的含量，結果見表2。

表2 蛇莓提取物中香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚含量

3 討論

3.1檢測波長的確定 分別將香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚4種成分的單一對照品溶液經紫外全波長掃描，發現香草酸在波長327和260 nm處有最大紫外吸收，異槲皮苷在波長356和255 nm處有最大紫外吸收，染料木素在波長363和259 nm處有最大紫外吸收，山柰酚在波長368和252 nm處有最大紫外吸收，綜合上述4種成分的最大紫外吸收，初步選擇350和260 nm作為檢測波長，但后續實驗發現供試品溶液在350 nm波長檢測時基線更為平穩，故最終選擇350 nm作為本實驗的檢測波長。

3.2流動相的確定 初始采用甲醇-水以及乙腈-水系統等度洗脫檢測供試品溶液中香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚4種成分，結果供試品中香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚以及其他成分難以達到完全分離，故進一步采用梯度洗脫系統對蛇莓提取物中上述4種成分進行測定，結果發現乙腈-水梯度洗脫能夠使得香草酸、異槲皮苷、染料木素、山柰酚以及其他成分分離度良好。由于香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚四種成分均含有酚羥基，在水中易發生電離，產生拖尾，故在流動相中加入不同比例濃度的甲酸、磷酸及冰醋酸，結果表明當加入0.05%磷酸可使峰型顯著改善。

本實驗研究建立了同時測定蛇莓提取物中香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚含量的HPLC法，通過HPLC測定得出蛇莓提取物中香草酸、異槲皮苷、染料木素及山柰酚含量分別為5.904，17.535，9.011，10.788 mg·g-1。該方法簡便快捷、準確可靠，重復性高，可為蛇莓提取物的質量評價與控制奠定實驗基礎。