腦梗塞大鼠病理模型神經干細胞的變化及中藥的影響

王陽 藍海燕 王鎮波 陳剛 吳旭庭 黃仲堅

【摘要】 目的 探討腦梗塞大鼠病理模型神經干細胞的變化及中藥的影響。方法 購置Wistar大鼠90只， 隨機取20只作為空白對照組;70只建立腦梗塞大鼠病理模型， 建模成功后隨機分為模型對照組（40只）和低、中、高劑量中藥組（各10只）?？瞻讓φ战M、模型對照組術后35、40、45、50、55、60 d分批處死大鼠， 免疫組織化學法檢測5-溴脫氧尿苷（Brdu）+標記陽性細胞， 確定海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量?？瞻讓φ战M、模型對照組均常規喂養， 低、中、高劑量中藥組用補陽還五湯干預， 60 d后對各組效果進行評估比較。結果 模型對照組術后35、40、45、50、55、60 d海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量均高于空白對照組， 差異有統計學意義（P<0.05）;模型對照組隨著檢測時間的延長神經干細胞數量呈下降趨勢， 不同時間點比較差異有統計學意義（P<0.05）。高劑量中藥組海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量分別為（38.47±3.10）、（19.32±1.59）、（7.14±1.43）、（7.97±1.31）、（4.02±1.01）， 中劑量中藥組分別為（43.45±3.23）、（21.85±0.67）、（8.64±1.67）、（8.21±1.26）、（4.75±1.14）， 低劑量中藥組分別為（38.43±3.16）、（19.36±0.61）、（7.13±0.89）、（7.95±1.13）、（4.00±0.99）， 模型對照組分別為（13.79±3.29）、（5.49±1.11）、（2.79±1.43）、（3.16±0.78）、（1.82±0.12）， 空白對照組分別為（7.71±2.31）、（3.25±0.59）、（2.42±0.42）、（1.12±0.23）、（0.92±0.11）;高、中、低劑量中藥組海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量明顯高于模型對照組和空白對照組， 差異有統計學意義（P<0.05）;中劑量中藥組海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量增加明顯。結論 腦梗塞大鼠病理模型的建立能激活神經干細胞活性， 使神經干細胞增殖分化， 補陽還五湯能促進神經干細胞增殖分化， 使神經功能恢復， 以中劑量藥物更利于神經再生。

【關鍵詞】 補陽還五湯;腦梗塞病理模型;神經干細胞;電脈沖刺激

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.21.091

腦梗塞是由于腦部血液供應障礙、缺氧或缺血引起的局限性腦組織缺血性壞死或軟化。臨床上， 將腦梗塞分為腦血栓形成、腔隙性梗死和腦栓塞等， 占全部腦卒中的80%[1]。臨床研究表明， 腦梗塞與糖尿病、高血壓、心律失常等疾病有關， 臨床多表現為猝然昏倒、半身不遂、言語障礙等， 影響患者的健康、生活。目前， 對于腦梗塞的治療臨床上采用中藥及針灸方法一直是傳統醫學的優勢與特點。補陽還五湯是中醫代表性處方， 且該方的研究從藥理作用、配方規律及物質基礎均具有大量研究。但是， 國內外研究更多的集中在腦卒中的急性期腦缺血性損傷， 給藥時間較短， 導致理論與臨床存在一定差距[2]。近年來， 隨著醫療技術的不斷發展， 神經干細胞治療神經系統疾病成為嶄新的領域， 但是其具體機制尚未闡明。因此， 本研究以Wistar大鼠作為研究對象， 探討腦梗塞大鼠病理模型神經干細胞的變化及中藥的影響， 報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 2018年8月～2019年5月購置于醫科大學實驗動物房Wistar大鼠90只， 雄性， 體重230～

280 g， 完成大鼠的常規喂養、光照。隨機取20只作為空白對照組;70只建立腦梗塞大鼠病理模型， 建模成功后隨機分為模型對照組（40只）和低、中、高劑量中藥組（各10只）。

1. 2 儀器與設備 4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司）、蘇木素-伊紅（HE）染色（北京索萊寶科技有限公司）、PBS緩沖液（北京博奧森生物技術有限公司）、酶標儀（美國賽默飛世爾科公司）、組織切片機（德國Leica公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus）等。

1. 3 方法

1. 3. 1 動物模型建立 對大鼠用10%水合氯醛完成腹腔麻醉， 用立體定位儀固定大鼠， 在右眼與右耳連線上做長為1.5 cm的切口， 鈍性分離顳肌， 充分暴露顳骨。在倒置顯微鏡下予牙科鉆在鱗狀骨與顴骨交界處向嘴側1 mm所對的鱗骨上鉆直徑為2 mm的小孔;用11號手術刀切開硬膜， 充分暴露大腦中動脈（MCA）并予電凝阻斷， 顳肌復位， 縫合傷口， 模擬腦梗塞。術后24 h用“大鼠隨機電脈沖刺激儀”（自制， 模擬勞則耗氣、驚則氣亂發病因素， 加重損傷刺激， 使大鼠肢體偏癱癥狀延遲恢復， 未刺激手術大鼠由于其特殊腦血管分布， 側支循環建立， 一般1周內偏癱癥狀恢復）連續刺激15 d， 刺激方式：平均每30分鐘刺激1次， 持續1 min/次， 頻率0.5 Hz， 電壓5～60 V逐漸調高。以行為變化（神經功能缺失）評分、外在表現、神經傳導速度、肌電變化、經顱多譜勒（TCD）檢查和腦組織病理學改變， 血及腦組織能量代謝， 微循環及血液流變學變化為主要模型判定指標[3]。

1. 3. 2 干預方法 空白對照組、模型對照組均常規喂養。低、中、高劑量中藥組用補陽還五湯干預。補陽還五湯：生黃芪120 g、當歸尾6 g、地龍3 g、赤芍4.5 g、紅花3 g、川芎3 g、桃仁3 g， 經高溫蒸餾水配制成補陽還五湯。低劑量組藥物濃度5 g/kg， 中劑量組藥物濃度7.5 g/kg， 高劑量組藥物濃度10 g/kg， 灌胃2次/d， 60 d后對各組效果進行評估。

1. 4 觀察指標

1. 4. 1 空白對照組與模型對照組神經干細胞變化 空白對照組（10只）、模型對照組各時間點（術后35、40、45、50、55、60 d）（5只）以斷頸處死大鼠， 處死前均注射Brdu， 免疫組織化學法檢測Brdu+標記陽性細胞， 確定標記海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量， 并對空白對照組與模型對照組神經干細胞變化進行比較。

1. 4. 2 高、中、低劑量中藥組及模型對照組、空白對照組神經干細胞變化? ?取高、中、低劑量中藥組大鼠10只， 以斷頸方式處死， 完成神經干細胞數量的測定。對高、中、低劑量中藥組及模型對照組、空白對照組神經干細胞變化進行比較。

1. 5 統計學方法 采用SPSS22.0統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 空白對照組與模型對照組神經干細胞變化比較

模型對照組術后35、40、45、50、55、60 d海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量均高于空白對照組， 差異有統計學意義（P<0.05）;模型對照組隨著檢測時間的延長神經干細胞數量呈下降趨勢， 不同時間點比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 高、中、低劑量中藥組及模型對照組、空白對照組神經干細胞變化比較 高劑量中藥組海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量分別為（38.47±3.10）、（19.32±1.59）、（7.14±1.43）、（7.97±1.31）、（4.02±1.01）， 中劑量中藥組分別為（43.45±3.23）、（21.85±0.67）、（8.64±1.67）、（8.21±1.26）、（4.75±1.14）， 低劑量中藥組分別為（38.43±3.16）、（19.36±0.61）、（7.13±0.89）、（7.95±1.13）、（4.00±0.99）， 模型對照組分別為（13.79±3.29）、（5.49±1.11）、（2.79±1.43）、（3.16±0.78）、（1.82±0.12）， 空白對照組分別為（7.71±2.31）、（3.25±0.59）、（2.42±0.42）、（1.12±0.23）、（0.92±0.11）;高、中、低劑量中藥組海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量明顯高于模型對照組和空白對照組， 差異有統計學意義（P<0.05）;中劑量中藥組海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量增加明顯。見表2。

3 討論

中樞神經系統內存在不斷更新、分化潛能的神經干細胞已經成為共識， 但是腦梗塞對細胞數量及結構的影響研究較少。本研究中以大鼠作為對象， 建立腦梗塞大鼠病理模型， 分析其對神經細胞的影響。臨床研究表明：Brdu能標記具有增殖活性的細胞， 而卵蛋白是神經前體細胞或神經細胞的特征性生物學標記。為了避免其他因素對腦內細胞的增殖， 本研究中給予Brdu+/Nsetin+雙標陽性細胞確定增殖的神經細胞， 結果顯示：模型對照組術后35、40、45、50、55、60 d海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量均高于空白對照組， 差異有統計學意義（P<0.05）;模型對照組隨著檢測時間的延長神經干細胞數量呈下降趨勢， 不同時間點比較差異有統計學意義（P<0.05）。說明腦梗塞大鼠病理模型的建立能激活神經干細胞活性， 可直接參與疾病的發生、發展， 可能與激活的神經細胞遷移、進一步分化有關。中醫是腦梗塞常用的治療干預方法， 能充分發揮中醫辨證施治的效果。本研究中， 以補陽還五湯對大鼠進行干預， 方藥由生黃芪、當歸尾、地龍、赤芍、紅花、川芎、桃仁組成。方藥中生黃芪具有利尿消腫、補氣、止汗功效;當歸尾多用于經閉不通、瘀血積滯;地龍具有通絡、平喘、利尿功效;赤芍具有清熱涼血、活血祛瘀功效;紅花具有活血通經、散瘀止痛功效;川芎具有活血祛瘀、行氣開郁、祛風止痛功效;桃仁具有活血祛瘀、止咳平喘功效;諸藥共奏， 能發揮補氣、活血、通絡功效[4]。補陽還五湯用于腦梗塞大鼠中能減輕其腦部損傷， 利于大鼠恢復。本研究中， 高、中、低劑量中藥組海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量明顯高于模型對照組和空白對照組， 差異有統計學意義（P<0.05）;中劑量中藥組海馬區BrdU+細胞、BrdU+/NeuN+細胞、BrdU+/PSA-NCAM+細胞、BrdU+/GFAP+細胞、BrdU+/CNPas+細胞數量增加明顯。說明中劑量補陽還五湯干預更能提高神經干細胞活性。

綜上所述， 腦梗塞大鼠病理模型的建立能激活神經干細胞活性， 使神經干細胞增殖分化;補陽還五湯能促進神經干細胞增殖分化， 使神經功能恢復， 以中劑量藥物更利于神經再生。

參考文獻

[1] 譚峰， 王健， 陳晶， 等. 電針對MCAO模型大鼠海馬區內源性神經干細胞表達的影響. 中國中西醫結合雜志， 2017， 37（2）：198-203.

[2] 李振， 程丹丹， 陳偉， 等. 褪黑素對腦缺血再灌注大鼠神經干細胞增殖的影響及機制研究. 中華神經科雜志， 2018， 51（12）：977-984.

[3] 平鍵， 陳紅云， 周揚， 等. 骨髓間充質干細胞移植對四氯化碳大鼠肝損傷的影響及一貫煎的干預作用. 中國中藥雜志， 2018（19）：3905-3912.

[4] 楊永祥， 葉玉勤， 蘇鑫洪， 等. 創傷性腦損傷后大鼠海馬區神經干細胞增殖及其與Janus激酶2/信號傳導與轉錄激活因子3信號通路活性的關系. 中華創傷雜志， 2019， 35（5）：416-422.

[收稿日期：2020-03-23]