CD133通過上皮間質轉化促進乳腺癌細胞MDA-MB-231的侵襲及轉移

韓亞娟,艾力江·卡德爾,張競競,王強強,韓正全

(蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤內科,蚌埠 233000;*通訊作者,E-mail:dochyj@163.com)

乳腺癌發病率和死亡率居女性惡性腫瘤之首,對女性的健康和生命構成嚴重威脅[1]。雖然近年來乳腺癌的治療手段取得較大進展,但復發和轉移是乳腺癌患者總的生存率并沒有明顯提高的主要原因。在最近的研究中發現,腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)在乳腺癌的發生和轉移中發揮著關鍵的作用,其特異性標志物CD133[2]又被稱為promin-1,是一種跨膜糖蛋白,首先發現于白血病細胞中,后來在正常組織中發現也有廣泛表達,表達的細胞均具有干細胞的特性。近年來,CD133已被用作結腸癌[3]、肝癌[4,5]、顱內惡性腫瘤[6]、肺癌[7]、前列腺癌[8]等腫瘤干細胞分類的特異性表面分子標記。CD133的表達與腫瘤的復發、轉移及對化療、放療等傳統療法的耐受性有關,與許多腫瘤預后不良有關。O喙匱芯勘礱鰨CD133在發生上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)的乳腺癌組織中更為明顯,表明癌細胞可以通過EMT獲得干細胞特性[5]。通過EMT獲得更強的運動和侵襲能力的乳腺癌細胞可以在遠處形成繼發性轉移灶。因此,在深入研究EMT控制乳腺癌侵襲轉移的分子機制的基礎上,尋找調控乳腺癌細胞EMT的核心因子,不僅可以作為判斷乳腺癌預后的重要指標,而且是一個重要的研究目的,它將進一步發展有效的干預和治療方法,以阻止乳腺癌轉移。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集蚌埠醫學院第一附屬醫院4對新鮮乳腺癌組織及配對癌旁正常乳腺組織,所有患者術前均未接受化療、放療、內分泌治療及靶向治療等輔助治療。患者均簽署知情同意書,研究方案經蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 細胞與試劑

正常人乳腺細胞MCF-10A和乳腺癌細胞MDA-MB-231、SKBr3、MCF-7均購自中國科學院上海細胞研究所,DMEM、RPMI-1640培養基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司,胎牛血清(FBS)、Materigel膠購自浙江天杭生物科技股份有限公司,siRNA、NC均購自上海吉瑪基因有限公司,Lipofectamin2000及RNA反轉錄試劑盒由Thermo Scientific公司購買,總RNA提取試劑盒由博士德生物工程公司購買,TB Green TM primax ex Taq TM試劑盒由TaKaRa公司購買,一抗(E-cadherin、vimentin、N-cadherin、CD133)、β-actin及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠二抗均購于Abbkine科技有限公司,Transwell小室及BCA蛋白濃度測量試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 細胞培養及轉染

MDA-MB-231和MCF-7在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養,SKBR3在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養,MCF-10A在MCF-10A特殊培養基中培養;在37 ℃和5% CO2飽和濕度的培養箱中培養。轉染對象為處于對數生長期的細胞,要求轉染時細胞融合程度達到60%。轉染步驟嚴格按照轉染說明書進行,實驗分為control組(只轉染Lipofectamine?2000)、NC組(轉染Lipofectamine?2000和NC序列)和si-CD133組(轉染Lipofectamine?2000和si-CD133序列)。

1.4 總RNA提取及實時熒光定量PCR檢測

使用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養MDA-MB-231細胞,至細胞融合度達到60%時,按照Lipofectamine2000說明書進行轉染操作,轉染后48 h,用Trizol法提取細胞總RNA。將提取的總RNA按RNA反轉錄試劑盒(reverse-aid-first-strang-cDNA合成試劑盒)說明書反轉錄RNA為cDNA,合成的cDNA使用TB GreenTMPrimix Ex TaqTM試劑盒通過PCR儀進行擴增檢測,以GAPDH為內參檢測CD133表達。最終Ct值采用2-ΔΔCt方法分析。實時熒光定量PCR采用兩步PCR擴增標準程序。引物序列見表1。步驟1:預變性(95 ℃,30 s);步驟2:PCR反應(95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s),共40個循環。所有試驗均重復3次。

表1 PCR擴增引物序列Table 1 PCR amplification primer sequences

1.5 Western blot檢測E-cadherin、vimentin、N-cadherin、CD133蛋白表達

分別將control組、NC組和si-CD133組細胞裂解提取后提取蛋白,以及將4對新鮮乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織研碎加入裂解液提取蛋白。使用BCA法測蛋白質濃度,于SDS-PAGE上取等量蛋白樣品進行電泳,PVDF膜轉膜,快速封閉液封閉15 min,一抗(E-cadherin、vimentin、N-cadherin、CD133、β-actin)按1 ∶1 000稀釋,4 ℃條件下孵育過夜。TPBS溶液洗3次,每次洗10 min,二抗按1 ∶5 000稀釋,室溫下孵育2 h,TPBS溶液洗3次,曝光顯影。

1.6 Transwell檢測細胞侵襲能力

將Materigel膠與無血清DMEM培養基按1 ∶8的比例稀釋,每孔加入60 μl的Materigel膠均勻覆蓋Transwell小室底部,培養60 min使之呈半凝固態。control組、NC組、si-CD133組分別取對數生長期的MDA-MB-231細胞,每組設3個復孔,消化離心后,用無血清培養基重懸計數。于37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養48 h;取出小室;PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定15 min,用結晶紫染液室溫下染色10 min;PBS漂去多余染料,在200×視野下觀察透膜細胞數,計數并求平均值。侵襲抑制率(%)=(1-si-CD133組侵襲細胞個數/control組細胞侵襲個數)×100%。

1.7 Transwell檢測細胞遷移能力

無需鋪基質膠外分別取對數生長期的control組、NC組、si-CD133組的MDA-MB-231細胞,每組設3個復孔,消化離心后,用無血清培養基重懸于小室中。于37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養24 h;取出小室;PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定15 min,用結晶紫染液室溫下染色10 min;PBS漂去多余染料,在200×視野下觀察透膜細胞數。計數并求平均值,所有實驗重復3次。遷移抑制率(%)=(1-si-CD133組侵襲細胞個數/control組細胞侵襲個數)×100%。

1.8 統計學分析

采用SPSS21.0統計軟件對實驗數據進行統計分析。實驗數據均以均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析及兩因素方差分析,組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗,P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CD133基因在不同乳腺癌細胞系中的表達水平

Western blot實驗結果表明,與MCF-10A相比,乳腺癌細胞中MDA-MB-231、SKBR3和MCF-7的CD133表達明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05,見圖1)。由于MDA-MB-231細胞中CD133表達升高最顯著,因此選擇MDA-MB-231細胞進行后續研究。

與MCF-10A細胞相比,* P <0.05圖1 CD133在正常人乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達Figure 1 Expression of CD133 in normal breast epithelial cells and breast cancer cells

2.2 Western blot法檢測乳腺癌組織中CD133蛋白的表達

Western blot結果表明,與正常乳腺組織相比,乳腺癌組織中CD133表達更高(P<0.05,見圖2)。

與相應的正常組織相比,* P <0.05;N代表正常乳腺組織,T代表乳腺癌組織圖2 Western blot法檢測乳腺癌組織中CD133蛋白的表達Figure 2 Expression of CD133 protein in breast cancer tissues by Western blot

2.3 篩選效果最佳的CD133特異性siRNA序列

Western blot和熒光定量PCR結果顯示,siRNA-3對乳腺癌MDA-MB-231細胞中CD133 mRNA和蛋白的干擾效果最好,與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05,見圖3)。因此我們選擇siRNA-3進行后續研究。

與control組比較,* P <0.05圖3 三條靶向不同區域的特異性siRNA轉染48 h對乳腺癌MDA-MB-231細胞CD133干擾效果Figure 3 Transfection efficacy of CD133 in MDA-MB-231 cells after transfected with three specific siRNA transfection targeted at different regions for 48 h

2.4 下調CD133基因后對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲、遷移能力的影響

為了解下調CD133對MDA-MB-231細胞侵襲遷移能力的影響,實驗分為control組、NC組、si-CD133組,下調CD133表達后,Transwell實驗結果顯示,48 h si-CD133組跨膜細胞數少于control組和NC組,差異有統計學意義(P<0.05,見圖4)。與control組和NC組相比,24 h si-CD133組乳腺癌細胞的遷移能力降低,差異有統計學意義(P<0.05,見圖4)。以上證明,下調CD133表達能抑制MDA-MB-231細胞侵襲、遷移能力。

與NC及control組比較,* P <0.05圖4 Transwell小室檢測下調CD133基因后對乳腺癌MDA-MB-231細胞侵襲、遷移能力的影響Figure 4 Effect of down-regulation of CD133 gene on the invasion and migration ability of breast cancer MDA-MB-231 cells by Transwell

2.5 MDA-MB-231細胞下調CD133基因對EMT相關蛋白E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達的影響

Western blot結果顯示,si-CD133組vimentin、N-cadherin的表達率低于NC組和control組。相反,E-cadherin在轉染組中的表達程度高于NC組和control組,差異具有統計學意義(P<0.05,見圖5)。同樣,熒光定量PCR結果同樣證明了CD133基因在MDA-MB-231細胞中的低表達能下調vimentin、N-cadherin的表達,且上調E-Cadherin的表達,差異有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

與NC組及control組比較,* P <0.05圖5 下調MDA-MB-231細胞CD133基因對EMT相關蛋白E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達的影響Figure 5 Effect of down-regulating CD133 gene on the expression of EMT-related proteins E-cadherin, vimentin, N-cadherin in MDA-MB-231 cells

3 討論

乳腺癌是一種異質性疾病,具有多種風險因素,包括環境、飲食、遺傳和表觀遺傳等。雖然有統計數據顯示,Ⅰ期乳腺癌病人的5年生存率可以達到97.9%,Ⅱ、Ⅲ期病人的5年生存率也達到75%和61%,但仍有20%-30%乳腺癌病人發生復發和轉移[9],因此,尋找有效抑制乳腺癌復發和轉移的機制具有重要的意義。最近的研究為腫瘤干細胞(CSCs)假說[10]提供了強有力的支持,該假說認為許多癌癥,包括乳腺癌,是由具有干細胞特性的細胞亞群驅動的。這些細胞可能介導轉移,并且由于它們對化療和放療的相對耐藥性,導致治療復發。CD133分子是腫瘤干細胞的特征性表面標志物之一。CD133是Prominin家族的成員之一,又名Prominin-1,是一種跨膜糖蛋白,具有5個跨膜區。定位于細胞膜上表面突起[11,12],是分離腫瘤干細胞最具代表性的生物標志物之一。CD133在胰腺導管腺癌EMT水平的腫瘤轉移中起重要作用[13,14],而其在乳腺癌中的功能作用尚不明確。我們觀察到,將正常乳腺上皮細胞與乳腺癌細胞中CD133蛋白表達量進行檢測,結果表明,與正常乳腺上皮細胞相比,CD133在乳腺癌細胞中明顯高表達。為進一步驗證這個結果,通過Western blot檢測乳腺癌組織及正常乳腺組織中CD133蛋白表達量,結果同樣表明,CD133在乳腺癌組織中表達量明顯升高。由此說明,CD133在乳腺癌中具有表達差異。為進一步探究CD133的生物功能學作用,我們將CD133-siRNA轉染進入MDA-MB-231細胞中,結果顯示CD133-siRNA組CD133基因和蛋白的相對表達量較陰性對照組和空白對照組明顯降低,說明實驗設計合成的干擾序列能特異性抑制CD133基因的表達。Transwell實驗顯示CD133-siRNA組細胞侵襲和遷移能力明顯受到抑制。最終得出結論,CD133能夠促進乳腺癌細胞MDA-MB-231的侵襲遷移能力。相關文獻表明,CD133在三陰性乳腺癌及轉移淋巴結組織中過度表達,預示著乳腺癌患者預后不良,這對于醫師及時給予恰當的干預治療非常重要[15]。

上皮間質轉化(EMT)是指完全分化的上皮細胞向間質細胞分化的過程。EMT在胚胎發育和創傷愈合中是生理的[16],但在癌癥中是病理的,它賦予細胞高度侵襲性的特征,促進傳播、治療抗性和復發[17]。EMT可導致細胞骨架重組、細胞間黏附喪失、頂端-基底極性異常,從而增強癌細胞的活力和侵襲能力。為了確定CD133介導的促進MDA-MB-231細胞侵襲和遷移的機制,我們研究了與EMT相關的蛋白E-cadherin、N-cadherin和vimentin。當癌細胞轉移時,E-cadherin失去其功能,導致細胞通過血液循環[18]轉移到其他器官。E-cadherin表達下調和N-cadherin表達上調在EMT過程中至關重要,在腫瘤轉移過程中誘導細胞黏附于基質并增強腫瘤細胞的侵襲能力[19,20]。Snail是EMT進程中最重要的分子之一,它與E-cadherin啟動子的E-box區域結合,直接抑制E-cadherin DNA轉錄,降低其蛋白表達,促進EMT[21]。在EMT過程中,細胞黏附能力的喪失伴隨著分子類型的改變,包括上皮細胞結構蛋白表達減少,間充質細胞結構蛋白表達增加。本研究結果表明,下調CD133表達后,上皮性的表型E-cadherin表達顯著升高,而間充質表型vimentin、N-cadherin等表達顯著降低。提示CD133通過EMT途徑促進乳腺癌細胞侵襲和轉移。

綜上所述,CD133通過EMT途徑促進乳腺癌細胞侵襲和轉移。抑制CD133表達可顯著抑制乳腺癌復發和轉移能力,因此研發靶向敲除CD133的藥物可能為乳腺癌的臨床治療提供新的思路。