新疆地區維吾爾族GABA(A)受體基因多態性與癲癇的關系

高 華,齊會珍,毛潔萍,楊新玲

(1 新疆醫科大學第五附屬醫院神經內科,烏魯木齊 830011;2 新疆烏魯木齊市友誼醫院神經內科;3 新疆醫科大學第二附屬醫院;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

癲癇是腦神經元異常放電產生的一種腦功能失調臨床綜合征,以藥物治療為主,但仍有約1/3的癲癇患者在治療后仍有不同類型的發作,成為耐藥性癲癇。對于耐藥機制的探究已成為癲癇研究熱點,其中抗癲癇藥物靶分子結構改變是促使藥物敏感性降低的原因之一。含有5個亞基的GABA(A)受體作為抗癲癇藥物的核心靶點之一,其受體亞基單核苷酸多態性與癲癇易感性及其耐藥性的聯系也日益受到關注。對癲癇患者的GABA(A)受體亞基基因多態性進行篩查時發現,其中部分單核苷酸基因多態性與癲癇或/和其耐藥存在關聯性[1,2]。

癲癇與個體遺傳、種族特點和地域環境差異有關[3,4],新疆作為以維吾爾族聚集為主的區域,具有其特有的種族特異性和地域特點。基于此特點,本實驗開展在維吾爾族癲癇患者人群中GABA(A)受體基因多態性與其癲癇、耐藥癲癇的相關性研究,旨在為區域民族癲癇病提供遺傳學依據。同時,也有助于早期篩查耐藥性癲癇的高危人群,為個體化治療的方案及遠期預后評估提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選擇2017-01～2018-08在新疆醫科大學附屬醫院住院或門診確診的85例維吾爾族癲癇患者為研究對象。入選標準:①年齡>14歲;②發作至少有2次且間隔至少24 h以上,病史及腦電圖(electroencephalogrphy,EEG)檢測支持癲癇診斷;③頭顱CT或MRI檢查排除繼發性癲癇。根據2010年國際抗癲癇聯盟的耐藥性癲癇定義[5],85例癲癇患者包括耐藥性癲癇32例,非耐藥性癲癇53例。正常對照組90例,均來自同時期體檢正常的維吾爾族(無發作記錄)。本研究經新疆醫科大學第五附屬醫院學術倫理委員會討論通過,入選人員均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采集所有入選者靜脈血2 ml,DNA提取試劑盒(天根基離心柱型)進行全組DNA的提取,提取過程及步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 引物設計 GABA(A)受體基因rs211037,rs201987位點引物設計由上海生工生物合成。引物序列見表1。依據設計的引物序列,進行進一步的PCR擴增。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.3 測序 對GABA(A)受體基因rs211037,rs201987基因位點,選取各樣品的PCR產物10 μl進行直接測序(上海生工生物公司完成)。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般臨床資料的比較

癲癇病例組與對照組在性別、年齡因素均衡性分析后,兩組間一般資料對比差異無統計學意義,基線一致(P>0.05,見表2)。

表2 各組一般資料比較Table 2 Comparison of general clinical data between different groups

2.2 遺傳平衡檢驗

癲癇組和對照組人群中GABA(A)受體基因rs211037(χ2=2.751,P>0.05),rs201987(χ2=0.933,P>0.05)位點的遺傳平衡狀態符合Hardy Weinberg定律。

2.3 GABA(A)受體基因rs211037,rs201987位點PCR擴增及直接測序分析

rs211037,rs201987兩個基因位點的擴增產物,目的片段大小分別在566 bp和417 bp處可以獲得(見圖1)。rs211037,rs201987位點直接測序圖:樣本表達為CC、CT、TT三種不同基因分型(見圖2)。

圖1 rs211037,rs201987位點的PCR擴增產物電泳圖Figure 1 Electrophoresis of PCR amplification products at rs211037,rs201987

圖2 rs211037,rs201987位點基因分型Figure 2 Genotyping of rs211037 and rs201987

2.4 rs211037,rs201987位點的基因型和等位基因頻率在病例組和對照組的分布

病例組和正常對照組的兩組間的GABA(A)基因rs211037,rs201987位點均存在有CC、CT、TT三種基因類型。病例組中rs211037位點CC基因型頻率和C等位基因頻率變化與對照組相比,差異均無統計學意義(χ2=0.218,P>0.05;χ2=0.155,P>0.05);其rs201987位點的CC基因型頻率和C等位基因頻率在病例對照兩組間也存在差異無統計學意義(χ2=0.057,P>0.05;χ2=0.161,P>0.05,見表3,4)。

表3 rs211037位點基因型頻率、等位基因頻率在病例組與對照組的分布 次(%)Table 3 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs211037 site in case group and control group cases(%)

表4 rs211037位點基因型頻率、等位基因頻率在病例組與對照組的分布 次(%)Table 4 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs201987site in case group and control group cases(%)

2.5 rs211037,rs201987位點的基因型和等位基因頻率在癲癇耐藥組和非耐藥組的分布

在進行癲癇耐藥組和非耐藥組間的GABAARG2基因rs211037,rs201987位點分析,不論是在CC基因型頻率的比較,還是在C等位基因頻率的比較,兩組間差異均無統計學意義(χ2=0.009,P>0.05;χ2=3.089,P>0.05;χ2=0.339,P>0.05;χ2=0.564,P>0.05,見表5,6)。

表5 癲癇耐藥組和非耐藥組rs211037位點基因型頻率、等位基因頻率的分布 次(%)Table 5 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs211037 in in drug resistance group and drug-response group cases(%)

表6 癲癇耐藥組和非耐藥組rs201987位點基因型頻率、等位基因頻率的分布 次(%)Table 6 Distribution of genotype frequency and allele frequency of rs201987 in drug resistance group and drug-response group cases(%)

3 討論

癲癇發生的其中一重要的病理生理機制被認為是腦內興奮性遞質谷氨酸(Glu)和抑制性遞質γ-氨基丁酸(GABA)的遞質失衡學說,目前認為癲癇的發作與GABA介導的抑制性突觸電活動降低有關[6-10]。GABA與GABA(A)受體結合后,可以促使Cl-內流產生抑制性突觸后電位,減少或抑制神經元的放電達到細胞穩態化。故GABA(A)受體編碼基因改變時,可能導致GABA(A)受體結構變化或敏感性下降,造成癲癇發生,或者在抗癲癇藥物使用中,造成藥物敏感度下降而產生耐藥性癲癇。

目前研究表明,GABA(A)受體的功能狀態和癲癇發病有著密切聯系。在以往的動物實驗中,Richter等[11]體外培養的大鼠腦神經細胞中,可以通過GABA(A)受體上調使神經元電活動減弱。Gasior等[12]也發現在對抗戊四氮(Pentetrazol,PTZ)誘導的大鼠癲癇發作時,可以通過加奈索酮特異性地上調中樞神經系統中GABA(A)受體的表達而完成。與此同時,在對癲癇患者研究中也發現,GABA(A)受體基因的多態性也是造成癲癇產生和耐藥癲癇產生的因素之一):Gurba等[13]聲稱兒童失神癲癇與GABA(A)受體β3亞基的突變G32R有關。Wallace等[5]在一個以熱性驚厥和失神癲癇為主要發作形式的家系中發現了GABA(A)受體γ2亞基的突變R43Q。Ding等[14]發現青少年肌陣攣性癲癇中有GABA(A)受體亞基的突變導致其受體表達減少。在關于耐藥癲癇研究中,Kim等[15]發現GABRA的rsl2658835和rs35166395位點多態性與耐藥癲癇存在相關性。Kumari等[16]也發現GABRA的rs2279020與癲癇易感性和耐藥性有關。然而Kinirons等[17]發現在愛爾蘭地區人群癲癇患者中rs2279020位點多態性與耐藥性癲癇并無相關性,此結論與曹宇澤等[18]在中國漢族癲癇人群的研究結果相同。因此,綜合來說對于GABA(A)受體基因多態性的結論也并非一致。本試驗研究結果發現,GABA(A)受體基因rs211037,rs201987位點在所有入選病例中都存在有CC、CT、TT三種基因型表達。rs211037,rs201987基因位點不論在癲癇病例組和正常對照組之間,以及癲癇的耐藥性和非耐藥性分組中,它們的CC基因型頻率和C等位基因頻率的分布概率,差異均不存在統計學意義(P>0.05),從本次研究結論提示,GABA(A)基因rs211037,rs201987位點多態性在新疆維吾爾族人群和其癲癇病易感性無關聯,并且與癲癇耐藥性也無關聯性。本研究結論中與既往對癲癇漢族人群[18]及愛爾蘭癲癇人群[17]研究結論相似,均為陰性。

本試驗結果未能提示在新疆地區維吾爾族人群中GABA(A)受體基因多態性與癲癇有關,也未發現與癲癇耐藥性相關。分析可能的因素,一方面樣本量的大小,另一方面癲癇的不同發作形式,同時癲癇本身遺傳學特點可能也是造成目前陰性結果的相關原因。這有待于進一步擴大樣本量、以不同種族、地域以及多中心的多基因位點,進行更多的驗證,提高結論的一致性。