響應(yīng)面法優(yōu)化荷葉含片的制備工藝

楊敏，史崇穎，王燕華，李凌飛，趙存朝，田洋，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.國家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，云南昆明 650201）

荷葉（Nelumbinis folium），又稱蓮花莖、蓮莖，是蓮科蓮屬多年生草本挺水植物蓮荷的葉[1]。中國早在3000多年前就有其栽培記錄，夏季采摘，鮮用作為食材、曬干用作茶或加工為其他制品[1-3]。中醫(yī)學(xué)中荷葉味苦，歸心、肝、胃經(jīng)，具有涼血止血，消暑利濕的功效[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及藥理研究表明荷葉中除了含有植物共有的三大營養(yǎng)物質(zhì)、微量元素、鞣質(zhì)等成分外，還含有特有的生物堿（荷葉堿、原荷葉堿等）、黃酮、有機(jī)酸、皂苷、抗有絲分裂作用的堿性成分等，能有效抑制高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血脂、減肥、抗氧化等作用[5-8]。Huan Du等研究表明荷葉提取物具有降脂減肥、抗氧化、抑制高膽固醇血癥和動(dòng)脈硬化和抑菌等功效[9-11]，因此對(duì)于荷葉提取物的研究成為醫(yī)藥、食品界備受關(guān)注的焦點(diǎn)。

近年來，已有許多研究者利用酸水法、酶法、溶劑萃取法、超聲輔助提取等方法對(duì)荷葉中的活性成分進(jìn)行提取分離。例如蔣益虹等[8]利用正交優(yōu)化荷葉生物堿的提取工藝條件為固液體積比1∶35，加入pH值為2.5的檸檬酸水溶液，在85℃的溫度下提取1.75 h，最終得到生物堿提取液在波長418 nm下吸光度為1.285[5]。目前，荷葉的加工形式不多，常經(jīng)過烹飪制成荷葉包肉、荷葉粥等食用，雖然部分研究者開發(fā)了飲料、酸奶等，但市面上的荷葉產(chǎn)品主要為荷葉茶[6]。本研究以荷葉為原料制備水提物，利用噴霧干燥技術(shù)將其制成干粉，通過單因素試驗(yàn)添加一定輔料，利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化荷葉含片的最佳配方，研制具有一定功效的荷葉含片，并測定相關(guān)理化衛(wèi)生指標(biāo)。為荷葉的開發(fā)利用提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荷葉：山東微山湖；糖粉：上海代一食品有限公司；甘露醇：昆明合略商貿(mào)有限公司；三氯蔗糖：安徽金禾實(shí)業(yè)股份有限公司；檸檬酸：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；硬脂酸鎂：河南千志商貿(mào)有限公司；羧甲基淀粉鈉（carboxymethyl starch sodium，CMS-Na）、薄荷腦：北京北方霞光食品添加劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

200克手提式高速萬能粉碎機(jī)（DFT-200）：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；電子分析天平（CP64）：深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；離心機(jī)（TDL-5-A）：上海安亭科學(xué)儀器廠；噴霧干燥機(jī)（YC-018）：上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-2150B）：鄭州生元儀器有限公司；自動(dòng)旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī)（ZP-5A）：南通盛凱亞機(jī)械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 荷葉提取物制備

參考韓婷婷等[7]研究結(jié)果對(duì)荷葉進(jìn)行粉粹后過4號(hào)篩（65目），得到荷葉提取物。參考韓婷婷等[7-8]利用酸水法提取荷葉中的生物堿，固定料液比為1∶35（g/mL），加入pH值為2.5的檸檬酸水溶液，在85℃的溫度下提取1.75 h，4 000 r/min離心30 min，得到上清液，抽濾后進(jìn)行噴霧干燥，樣品在干燥暗室中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩⒖键S媛等[12]的方法，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定提取樣品中的生物堿含量，結(jié)果表明樣品中生物堿含量為（1.25±0.037）g/100 g，并根據(jù)荷葉堿含量對(duì)荷葉提取物進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，提取物中荷葉堿含量≥1.2 g/100 g時(shí)可用于荷葉含片的加工。

1.3.2 噴霧干燥工藝篩選

固定空氣壓力0.3 MPa，根據(jù)不同平均進(jìn)風(fēng)溫度（155、165、175、185、195 ℃）下的出風(fēng)溫度（50、60、70、80、90℃），測定荷葉提取物干粉的分散性、水分含量、得率，篩選最佳目標(biāo)溫度。同時(shí)，考察不同進(jìn)料流量 500、550、600、650、700 mL/h 對(duì)荷葉提取物的物性的影響。

1.3.3 荷葉含片輔料篩選

經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)篩選具有甜味和黏結(jié)性，可用于增強(qiáng)荷葉含片的硬度的糖粉及在溶解時(shí)能吸熱，有清涼甜味，對(duì)口腔有舒適感的甘露醇作為填充劑，其中糖粉添加量為片劑質(zhì)量的15%；選取具有顯著吸水膨脹作用，能夠破壞片劑結(jié)合力而使片劑裂碎成許多小顆粒，利于藥物溶解和吸收的羧甲基淀粉鈉作為崩解劑，其用量為片劑質(zhì)量的5%；選取具有疏水性，阻礙水的進(jìn)入，增加粉粒的光滑性，減少粉粒間的摩擦力、黏著力，降低片重差異和硬度的硬脂酸鎂作為潤滑劑，其用量為片劑質(zhì)量的3%；為獲得良好的口感，需加入甜味劑和清涼劑等進(jìn)行矯味。三氯蔗糖作為唯一以蔗糖為原料生產(chǎn)性甜味劑，甜味與蔗糖相似，穩(wěn)定性高，易溶于水，不吸濕，不致齲齒。故選用三氯蔗糖作為荷葉含片的甜味劑。薄荷腦具有良好的清涼作用，可作為荷葉含片的清涼劑，使含片具有清涼感，味道更佳，其薄荷腦用量為片劑質(zhì)量的2%。

1.3.4 荷葉含片主料選擇

固定糖粉添加量15%，羧甲基淀粉鈉用量5%，硬脂酸鎂用量3%，薄荷腦用量2%。以感官評(píng)分為指標(biāo)篩選甘露醇添加量（20%、30%、40%、50%、60%），荷葉提取物添加量（8%、10%、12%、14%、16%），三氯蔗糖添加量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）。

1.3.5 荷葉含片配方優(yōu)化

利用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以荷葉提取液經(jīng)過噴霧干燥后得到的荷葉提取物干粉，并以X1荷葉提取物添加量、X2甘露醇添加量、X3三氯蔗糖添加量為試驗(yàn)因素，以感官評(píng)分指標(biāo)為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。優(yōu)選出最好的荷葉含片配方，響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

1.3.6 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

1.3.6.1 感官評(píng)分

由10名同學(xué)組成評(píng)定小組，分別從色澤、口感、風(fēng)味、組織狀態(tài)，4項(xiàng)指標(biāo)對(duì)荷葉含片進(jìn)行打分，采用百分制。其中，色澤占20分，組織狀態(tài)和風(fēng)味占25分，口感占30分。評(píng)分結(jié)果取平均值，荷葉含片的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

1.3.6.2 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

根據(jù)SB/T 10347-2017《糖果壓片糖果》[13]測定含水量；根據(jù)朱振元等[14]方法測定硬度，根據(jù)《中國藥典》2015版[15]測定片重差異、脆碎度；參照GB 4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》[16]測定菌落總數(shù)。參照GB 4789.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[17]測定大腸桿菌。

表2 荷葉含片感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Nelumbinis folium inclusion sensory scoring standard

2 結(jié)果與分析

2.1 噴霧干燥工藝參數(shù)確定

2.1.1 目標(biāo)溫度的確定

固定進(jìn)料流量為600 mL/h，平均進(jìn)風(fēng)溫度分別為155、165、175、185、195 ℃時(shí)，出風(fēng)平均溫度 50、60、70、80、90℃，考察目標(biāo)溫度對(duì)噴霧干燥所得荷葉提取物的分散性、水分含量及得率影響如表3所示。

表3 不同平均進(jìn)風(fēng)及出風(fēng)溫度下所得荷葉粉的各指標(biāo)測定Table 3 Physical properties of Nelumbinis folium powder obtained from different inlet air temperatures

從表3中可以看出：隨著進(jìn)風(fēng)溫度及出風(fēng)溫度的升高，分散性先增大后減小，干提取物中的含水量逐漸降低，得率變化不大。進(jìn)風(fēng)溫度低時(shí)，荷葉提取物的水分含量高，所以粉粒之間易發(fā)生粘結(jié)和粘壁，因而分散性會(huì)變差。在175℃時(shí)得率最高，含水量也相對(duì)較低。進(jìn)風(fēng)溫度越高，噴霧干燥進(jìn)行時(shí)，荷葉粉越不容易粘壁，但噴頭處出現(xiàn)黏液和焦糊的現(xiàn)象就越嚴(yán)重。故設(shè)定目標(biāo)溫度為175℃，此時(shí)進(jìn)風(fēng)溫度為170℃～180℃，出口溫度為60℃～80℃，得到的荷葉提取物粉分散性好，水分含量低，得率為（3.73±0.12）%。

2.1.2 泵速的確定

固定目標(biāo)溫度為175℃，設(shè)定進(jìn)料流量分別為500、550、600、650、700 mL/h，考察進(jìn)料流量對(duì)噴霧干燥所得荷葉提取物的分散性、水分含量及得率。結(jié)果如表4所示。

由表4可見，物料進(jìn)料流量過小，進(jìn)入霧化器中后，易出現(xiàn)蒸發(fā)過度，荷葉提取物會(huì)因溫度過高而發(fā)生焦糖化，造成分散性變差，也給荷葉提取物的色澤風(fēng)味帶來不良影響，且噴頭會(huì)粘有大量的提取液。進(jìn)料流量過大，達(dá)到700 mL/h時(shí)，霧化器內(nèi)蒸發(fā)能力不夠，使荷葉提取物的水分含量較高，分散性變差。進(jìn)料流量過大過小，都會(huì)出現(xiàn)粘壁現(xiàn)象，但進(jìn)料流量過小時(shí)噴頭沒有黏液，而進(jìn)料流量過大噴頭黏液明顯。綜合考慮，進(jìn)料流量采用600 mL/h比較合適。

表4 不同進(jìn)料速度所得荷葉提取物的物理性質(zhì)Table 4 Physical properties of Nelumbinis folium extract obtained at different feed rates

2.2 荷葉含片配方確定

2.2.1 配方加工工藝確定

2.2.1.1 工藝流程

片劑的制備工藝主要有干法制粒壓片法和濕法制粒壓片法。本試驗(yàn)采用濕法制粒壓片，工藝如下：荷葉提取物+甘露醇+糖粉+CMS-Na→混勻→純水制濕粒→70℃干燥→總混（硬脂酸鎂、薄荷腦）→壓片→成品。

2.2.1.2 操作要點(diǎn)

1）純水制濕粒：按工藝條件，在混合好的荷葉粉和輔料（甘露醇、糖粉、CMS-Na等）中加入純水，調(diào)整物料濕度，制成軟硬適中的軟料，軟料的軟硬度一般以握之成團(tuán)、觸之即散為好。

2）干燥：將軟料均勻地鋪放在不銹鋼盤子，置于電熱恒溫干燥箱中，在70℃下干燥，每隔30 min翻動(dòng)1次，以加快干燥速度。干燥終點(diǎn)以手捏時(shí)手感干脆、不粘手，用力一捏可捏碎為宜。

3）壓片：將混合好的原料粉傾倒與壓片機(jī)中，進(jìn)行壓片，去掉表面不光滑及有缺口的含片。

2.2.2 荷葉含片主料確定

原料添加量對(duì)荷葉含片品質(zhì)的影響見圖1。

圖1 原料添加量對(duì)荷葉含片品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of raw material content on the quality of Nelumbinis folium lozenges

如圖1（a）所示，隨著荷葉提取物添加量的提高，荷葉含片的感官評(píng)分呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，荷葉提取物添加量為10%，感官評(píng)分值最大。可能是由于荷葉提取物中含有大量單寧、黃酮、生物堿等活性因子，具有一定的苦澀味，荷葉提取物添加量增加，感官評(píng)分值下降；如圖1（b）所示，隨著甘露醇添加量的增加，感官評(píng)分呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在添加量為50%時(shí)，感官評(píng)分值最大。甘露醇具有清涼甜味，添加量增加使荷葉含片的甜度、清涼感增加，掩蓋了荷葉特有風(fēng)味；如圖1（c）所示，隨著三氯蔗糖添加量的增加，感官評(píng)分先增大后減小，添加量為2%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最大值。三氯蔗糖作為唯一以蔗糖為原料生產(chǎn)的功能性甜味劑，其甜度是蔗糖的600倍，過量添加后甜味過重且出現(xiàn)苦味，影響感官評(píng)分。故選取荷葉提取物添加量10%，甘露醇添加量50%，三氯蔗糖添加量2%作為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的0水平。

2.2.3 響應(yīng)面配方優(yōu)化

2.2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)曲面分析法是一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)學(xué)的綜合試驗(yàn)技術(shù)，運(yùn)用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)的方法將因素及因素間的交互作用和經(jīng)驗(yàn)技術(shù)以函數(shù)模型和圖形的方式顯示，便于篩選最佳工藝條件，被廣泛應(yīng)用于工藝優(yōu)化研究。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，建立Box-Behnken Design中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^擬合二次方程計(jì)算最優(yōu)工藝組合以及荷葉含片工藝最優(yōu)理論值。選擇荷葉提取物添加量（X1）、甘露醇添加量（X2）、三氯蔗糖添加量（X3）進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示。

表5 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table Response surface analysis and results

2.2.3.2 回歸模型

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)荷葉含片感官評(píng)分的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到編碼形式的二次回歸模型：

感官評(píng)分=87.96+1.2X1+2.1X2-3.6X3+0.3X1X2-0.1X1X3-2.1X2X3-5.63X12-8.73X22-9.53X33

2.2.3.3 方差分析

對(duì)所得模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析，如表6所示。

表6 方差分析結(jié)果Table 6 Variance analysis results

續(xù)表6 方差分析結(jié)果Continue table 6 Variance analysis results

由表6可知回歸方程的F值為61.90，其P值小于0.000 1，表明此模型無效性假設(shè)為真的可能性小于0.000 1，差異極顯著；X1、X2、X3三因素 P 值小于 0.05，對(duì)感官評(píng)分的影響都是顯著的。對(duì)回歸方程進(jìn)行失擬項(xiàng)檢驗(yàn) ：F=2.82，P=0.171 4＞P=0.05，不顯著，同時(shí)，決定系數(shù)R2=0.987 6，信噪比Adeq precisior=20.305，這表明方程的擬合度和可信度均很高，可用于荷葉含片感官評(píng)價(jià)預(yù)測。離散系數(shù)C.V（Y的變異系數(shù)）表示試驗(yàn)本身的精確度，C.V值越小，試驗(yàn)的可靠性和精密度越高，感官評(píng)分?jǐn)M合C.V值為1.83%。回歸模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，能夠準(zhǔn)確的分析和預(yù)測荷葉含片感官評(píng)分，說明試驗(yàn)操作可信度高，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。結(jié)合表6和回歸模型可知，單因素對(duì)荷葉含片顯著性影響依次為：X3＞X2＞X1。

2.2.3.4 響應(yīng)面分析結(jié)果

利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)出等高線圖和響應(yīng)曲面圖，考察因素間交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響。其中方差分析結(jié)果顯示甘露醇添加量和三氯蔗糖添加量交互作用顯著，結(jié)果如圖2所示。

圖2 甘露醇添加量、三氯蔗糖添加量對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.2 Effect of mannitol addition and sucralose addition on sensory score

當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著。圖2是通過二次回歸模型擬合的響應(yīng)面變化三維曲面，可直觀地反映甘露醇添加量（X2）、三氯蔗糖添加量（X3）對(duì)感官評(píng)分的影響。X2與X3之間交互作用顯著P=0.020 2＜0.05，對(duì)荷葉含片感官評(píng)分影響較大；隨甘露醇添加量和三氯蔗糖添加量的增加而呈先升高后下降的趨勢，甘露醇添加量及三氯蔗糖添加量為51%及1.9%時(shí)，荷葉含片的感官評(píng)分值最大，與單因素分析結(jié)果相符。

2.2.3.5 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

為檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法的可靠性，對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化的最佳配方進(jìn)行確定和驗(yàn)證，重復(fù)3次試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證Table 7 Determination of the best conditions and verification of the regression model

以感官評(píng)分為指標(biāo)得到最優(yōu)工藝參數(shù)為：荷葉提取物添加量10.23%，甘露醇添加量51.47%，三氯蔗糖添加量1.9%。優(yōu)化后感官評(píng)分預(yù)期值為88.55分。該試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值的誤差較小。這說明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的荷葉含片配方參數(shù)較準(zhǔn)確可靠，建立的試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂袑?shí)用價(jià)值。考慮實(shí)際生產(chǎn)調(diào)整荷葉粉添加量10%、甘露醇添加量51%、三氯蔗糖添加量1.9%。此時(shí)得到荷葉含片平均感官評(píng)分值為（86.23±2.55）分。

2.3 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)

按《中國藥典》2015年版二部附錄中，隨機(jī)抽取藥片10片，測定其水分、滋味、硬度、脆碎度、片重，結(jié)果如表8所示。

表8 荷葉含片質(zhì)量指標(biāo)檢測結(jié)果Table 8 Test results of Nelumbinis folium lozenge quality index

色澤：片劑表面色澤均勻，無雜質(zhì)、無異物；氣味：具有荷葉特有清甜香氣，風(fēng)味協(xié)調(diào)柔和；組織形態(tài)：呈片狀緊實(shí)細(xì)膩，無雜質(zhì)；口感：清甜可口，味道佳，風(fēng)味協(xié)調(diào)一致。

測量并計(jì)算得到含片平均片重0.520 g，片重范圍0.518 0 g～0.530 7g，符合藥典0.30 g及以上片重差異±5%的規(guī)定；含片硬度范圍在（4.59±0.006）kg之間，符合《中國藥典》中規(guī)定，硬度在3 kg～5 kg的規(guī)定。所有含片均未出現(xiàn)斷裂、龜裂及粉碎現(xiàn)象，脆碎度范圍在（0.36±0.020）%，減失質(zhì)量為0.48%，小于藥典規(guī)定的1%要求；水分≤4.6%。

細(xì)菌總數(shù)≤800 cfu/g。大腸菌群未檢出。致病菌不得檢出。微生物指標(biāo)符合GB 4789.1-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則》國家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本研究通過水提法將荷葉中有效成分提取濃縮后，篩選最佳噴霧干燥工藝參數(shù)，當(dāng)噴霧干燥目標(biāo)溫度為175℃，進(jìn)料流速600 mL/h時(shí)，得到荷葉粉分散性為96 s，水分含量為4.6%，水分含量低，得率為（3.73±0.12）%，該條件下得到的干粉分散性好，水分含量低品質(zhì)較優(yōu)，提取物中荷葉堿含量為（1.25±0.037）g/100 g。

在單因素基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化荷葉含片的最佳配方：荷葉粉10%、甘露醇51%、糖粉15%、糊精15%、羧甲基纖維素鈉5%，三氯蔗糖1.9%的配方添加量下，用濕法制粒壓片所得的荷葉含片清甜可口，穩(wěn)定性好，各項(xiàng)檢測指標(biāo)均符合要求，含片質(zhì)量穩(wěn)定。