Twist促進SKOV3細胞的血管生成擬態和上皮間質轉化

劉變利,王娟妮,劉小青,杜 娟,于銳利,尉春艷*

(1 西安交通大學第二附屬醫院婦產科,西安 710004;2 商洛市商州區婦幼保健院;*通訊作者,E-mail:weichy1023@163.com)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一,發病隱匿、進展快、5年生存率低[1]。深入研究EOC侵襲和轉移的機制并尋找有效的治療靶點,有望提高EOC患者生存率。實體腫瘤中的新生血管形成是腫瘤發展、侵襲轉移中的重要過程,當腫瘤原有的血管不能滿足生長需求時,一些腫瘤細胞就會改變它自身的功能、模擬內皮細胞的功能。在多種惡性腫瘤中均發現,由腫瘤細胞而非內皮細胞構成的微血管網絡,這種微血管結構被稱為血管生成擬態(vasculogenic mimicry,VM)[2],它被認為是惡性腫瘤血管新生的重要補充方式。另外研究發現,在高度VM形成的腫瘤中,上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的調節因子也高表達[3]。EMT是上皮細胞失去上皮特征轉化為具有間質表型細胞的過程[4]。排列緊密的上皮細胞失去胞間連接、表達間質細胞表面因子并獲得機動性以及遷移能力,被認為是腫瘤轉移的起始步驟[5],其發生標志是E-cadherin(E-鈣黏蛋白)的丟失[6]。E-cadherin是存在于上皮細胞中介導胞間黏附的重要因子,是公認的上皮標志物,編碼基因是CDH1。Twist可直接與CDH1的啟動子區域結合,進而抑制E-cadherin的表達[7]。

Twist屬于堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)轉錄因子家族,在包括EOC在內的多種惡性腫瘤組織中高表達,很多研究已經表明Twist與多種癌癥的發生、侵襲發展密切相關,并能為癌細胞的轉移創造條件。經前期研究[8]已經發現Twist能夠促進SKOV3細胞的增殖以及侵襲能力,而在實體腫瘤中,血管生成是必要條件,因此本實驗進一步研究了Twist能否促進EOC的新生血管生成以及VM和EMT過程,從而為進一步揭示上皮性卵巢癌的侵襲轉移機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

SKOV3細胞系購自上海中科院典型培養物保藏中心。Twist-shRNA 771、shRNA782和shRNA864序列合成(上海生工生物工程有限公司),LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen,美國),CD31-PAS雙染試劑盒(天根生化科技有限公司),SYBR Green試劑盒(Applied Biosystems,美國),RIPA裂解液(碧云天生物技術公司),DNA膠回收試劑盒(寶生物工程有限公司),Trizol(Invitrogen,美國);real time PCR試劑盒(北京全式金公司),CD31、CD34一抗(eBioscience,美國),E-cadherin一抗(Abcam,英國),Twist一抗(Santa Cruz,美國),Twist和CD31二抗(Santa Cruz,美國)。

細胞分為四組:Twist過表達載體組(Twist-over組)和抑制載體組(Twist-shRNA組)以及空白對照組(NC組)和空載體組(empty組)。

1.2 組織樣本

上皮性卵巢癌組織取自西安交通大學第二附屬醫院行卵巢癌手術的20例患者,術前未接受過放化療,根據FIGO 2012年卵巢癌手術-病理分期,早期(FIGOⅠ、Ⅱ期)卵巢癌5例,晚期(FIGO Ⅲ、Ⅳ期)卵巢癌15例;高分化者4例,中低分化者16例,年齡26-73歲,平均51歲;對照組為非惡性疾病行單側或者雙側卵巢切除的患者,年齡31-73歲,平均53歲。每位患者均同意臨床組織的捐獻并簽署知情同意書,本研究經我院人體實驗與倫理委員會批準。組織切除后均分為兩份:其一用液氮快速冰凍,-80 ℃凍存、檢測RNA表達;另一份石蠟切片后免疫組織化學染色和CD31-PAS雙重染色。

1.3 Twist-shRNA載體構建

設計合成人Twist-shRNA771、shRNA782和shRNA864序列的正向和反向DNA oligos,按以下體系配制退火反應體系:正義寡核苷酸(100 μmol/L)5 μl,反義寡核苷酸(100 μmol/L)5 μl,dNTPs 10 μl,Taq DNA聚合酶2.5 μl,NaCl 100 mmol/L,Tris-Cl pH 7.4 50 mmol/L,ddH2O 50 μl。運行以下PCR程序:90 ℃ 4 min,70 ℃ 10 min,55 ℃ 10 min,40 ℃ 10 min,25 ℃ 10 min。將pLentilox3.7載體(新霉素抗性,Clontech)按以下條件雙酶切:10×緩沖液2 μl,pLentilox3.7 1 μl,EcoR Ⅰ 1 μl,BamH Ⅰ 1 μl,ddH2O 15 μl,37 ℃、3 h。將酶切產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離,膠回收后純化、調整質粒濃度為0.5 μg/μl。按照以下體系連接:T4 DNA連接酶1 μl,酶切后的pLentilox3.7載體1 μl,退火寡核苷酸3 μl,10×連接酶Buffer 1 μl,ddH2O補足10 μl。轉化DH5α感受態細菌后測序鑒定。

1.4 Western blot檢測Twist和E-cadherin蛋白

裂解細胞后提取蛋白并檢測濃度。60 V 30 min、100 V 120 min電泳,轉膜后5%脫脂奶粉封閉,Twist(1 ∶500)、E-cadherin(1 ∶1 000)一抗4 ℃過夜,洗膜3次,山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)、山羊抗小鼠二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗膜3次后顯影。

1.5 real-time PCR檢測Twist和E-cadherin

Trizol法提取RNA并測定濃度、制備cDNA。Twist引物:5′-CGGGAGTCCGCAGTCTTA-3′、5′-CACGCCCTGTTTCTTTGA-3′,E-cadherin引物:5′-GGGTCTTGCTATGTTGCC-3′、5′-GTTCCGCTCTGTCTTTGG-3′。反應程序設置如下:95 ℃ 3 min,共40個循環。每個循環包括:95 ℃ 20 s,56 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s。每個樣品共3個平行重復,取平均值進行統計分析。

1.6 三維細胞培養

于35 mm培養皿中,將單細胞懸液滴種到蓋玻片(直徑18 mm)的人工基底膜上,37 ℃、30 min,貼壁加入2.5 ml的DMEM。每2 d換1次培養基。培養3 d鏡下觀察細胞的形態學改變。

1.7 CD31-PAS雙染

采用鏈霉素抗生物素-過氧化物酶連結(SP)法,固定腫瘤組織,血管內皮呈現棕黃色后,蒸餾水沖洗1 min,過碘酸溶液中氧化15 min,蒸餾水沖洗3 min、2次,Schiff液中避光、PAS反應15 min,蒸餾水洗1 min、3次,流水3 min,蘇木精5 min,流水2 min,分化、反藍,常規脫水、透明、樹膠封片。CD31表達陰性,PAS染色陽性的管腔,管腔內壁可見扁平腫瘤細胞覆蓋者為血管生成擬態。每個組織隨機選擇3個視野,計數VM數目。

1.8 流式細胞檢測

0.25%胰酶和0.02%EDTA消化細胞后、離心、PBS重懸,加入4%多聚甲醛,37 ℃ 10 min,冰上1 min。加入終濃度為90%的甲醇冰上放置30 min。2 ml孵育緩沖液漂洗,離心后100 μl孵育緩沖液重懸,室溫封閉10 min,加入CD34和CD31,室溫孵育1 h,2 ml孵育緩沖液漂洗,離心后將細胞重懸在0.5 ml PBS中,流式細胞儀檢測。

1.9 統計學分析

數據以均數±標準差的形式表示。采用SPSS軟件23.0版(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進行統計分析。采用單因素方差分析輔以Bonferroni檢驗,P<0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Twist沉默載體構建

與空白對照相比,轉染Twist-shRNA771、shRNA782和shRNA864載體后SKOV3細胞中Twist蛋白和mRNA的表達水平降低(見圖1);且Twist-shRNA782的抑制效率最高,因此后續實驗采用該沉默載體。利用Twist-shRNA782抑制載體以及此前實驗構建完成的過表達載體[9]進行real-time PCR檢測結果顯示:過表達載體以及沉默載體均可達到實驗要求。

與NC組比較,* P <0.05;與shRNA771和shRNA864組比較,#P <0.05圖1 不同Twist-shRNA和過表達載體轉染SKOV3細胞后Twist的表達Figure 1 Expression of Twist in SKOV3 after transfected with Twist-shRNAs and Twist-overexression vector

2.2 上皮性卵巢癌組織中血管生成擬態明顯增多

對上皮性卵巢癌組織和正常組織進行CD31染色發現:上皮性卵巢癌組織明顯高表達CD31(11.65±0.99vs8.10±0.86,P<0.05,見圖2)。對上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織進行CD31-PAS雙染后發現:上皮性卵巢癌組織中VM現象很常見,且伴隨缺氧加重VM也越發明顯;而正常卵巢組織多為組織自有血管,VM很少(5.25±0.56vs1.10±0.45,P<0.05,見圖2)。

箭頭為CD31陰性、PAS陽性;三角為CD31陽性、PAS陽性圖2 上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織中的血管生成擬態Figure 2 VM in epithelial ovarian cancer tissues and normal ovary tissues

2.3 Twist過表達可使CD31和/或CD34陽性的SKOV3細胞數量增加

CD31、CD34是血管內皮細胞的標記物,流式篩選結果顯示:空白組、空載體組以及Twist-shRNA782組間CD31和/或CD34陽性的細胞數無明顯差異;而Twist過表達組中,CD31和/或CD34陽性的SKOV3細胞明顯增多(P<0.05,見圖3)。

圖3 Twist過表達可使CD31和/或CD34陽性的SKOV3細胞數量增加Figure 3 Overexpression of Twist promotes CD31 and/or CD34 positive rate in SKOV3 cells

2.4 Twist過表達促進SKOV3細胞在三維培養條件下EMT的形成

對SKOV3細胞進行3D培養以明確Twist對于SKOV3細胞的EMT有無作用。發現Twist過表達組的細胞變狹長并形成明顯的管腔樣結構,而空白組和空載體組只有極少數細胞有輕微變形、也沒有管腔樣結構的形成,Twist-shRNA782組的SKOV3細胞未見明顯改變。Twist過表達組、空白組、空載組和Twist-shRNA782組EMT的形成依次為6.83±0.49,0.92±0.31,1.41±0.38和1.25±0.39(P<0.05,見圖4)。

圖4 Twist對三維培養后的SKOV3細胞EMT形成的作用Figure 4 The effect of Twist on EMT formation of SKOV3 cells after 3D culture

2.5 Twist能夠抑制E-cadherin的表達

E-cadherin作為Twist調控的下游靶點之一,與多種惡性腫瘤中EMT的發生和發展、VM的發生密切相關。SKOV3細胞轉染Twist過表達載體48 h,E-cadherin蛋白和mRNA表達水平顯著降低(見圖5);轉染抑制載體shRNA782 48 h,結果與過表達載體相反。

與empty組比較,* P <0.05圖5 Twist過表達能夠抑制E-cadherin的表達Figure 5 Twist overexpression inhibits the expression of E-cadherin protein and mRNA

3 討論

Twist基因于1983年首次發現,在胚胎發育中至關重要[10],還與惡性腫瘤的發生發展以及轉移密切相關。本課題在前期Twist過表達載體[9]的基礎上再次成功構建抑制載體Twist-shRNA782,用以研究Twist對SKOV3細胞在促進卵巢癌侵襲轉移的新生血管生成、EMT中的作用。

惡性腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移,需要豐富的血液供應。當內皮細胞構成的原有血管不能滿足腫瘤生長需求后,腫瘤細胞會改變其自身功能、模擬內皮細胞的功能。在多種惡性腫瘤中均發現由非內皮細胞構成的微血管網,也就是VM,它不僅為癌細胞提供營養,關鍵是其本質是由腫瘤細胞自身變形而來,直接增加了腫瘤與血液的接觸機會,使腫瘤細胞更易侵襲轉移[11]。本研究中CD31-PAS雙染結果顯示上皮性卵巢癌組織可見非內皮細胞構成的血管腔內壁,并可見到腔內有紅細胞,在壞死區域更為明顯,說明上皮性卵巢癌細胞的增殖導致癌灶中心區缺氧,缺氧誘導腫瘤細胞自身變形并形成管腔樣結構,以適應自身血供要求。通過構建的兩種Twist表達載體進一步研究Twist對于SKOV3細胞參與血管生成的影響發現,過表達Twist可導致CD31和/或CD34陽性的SKOV3細胞數量增加,意味著Twist可以促進SKOV3細胞向血管內皮細胞分化,可能是促進EOC細胞轉移的輔助因素。

有研究發現,在高度VM形成的腫瘤中,EMT的調節因子和相關的轉錄因子也高表達。雖然VM的具體形成機制還有待進一步研究,但目前認為EMT是其發生的關鍵因素和步驟。EMT[12]是胞間以及細胞與胞外間質間的連接發生了改變,導致上皮細胞失去極性、與周圍細胞脫離,并獲得遷移能力,從而轉化為具有間質表型細胞的過程,特征是上皮細胞標記物(如黏附分子)表達減少和間質細胞表面標記物表達增加、胞間缺乏連接、排列松散、黏附減少,脫落轉移潛能隨之增加。故EMT與惡性腫瘤細胞的轉移侵襲關系密切[13]。而上皮細胞表面標志物E-cadherin的丟失是EMT發生的標志[12]。有研究認為,Twist高表達、E-cadherin低表達可以作為非小細胞肺癌的重要預后因子[14],Twist能夠抑制E-cadherin的表達進而促進腎小管的上皮間質轉化以及纖維化[15]。對SKOV3細胞進行3D培養發現過表達Twist可導致SKOV3細胞變得更加狹長并形成明顯的血管腔樣結構,而Twist干擾組則未觀察到明顯變化;在形態學上重現了腫瘤初期的轉移變化。而過表達Twist明顯抑制E-cadherin的表達,充分說明Twist能夠抑制E-cadherin、促進SKOV3細胞EMT的發生。

本研究從腫瘤局部微觀的角度探討了SKOV3細胞的生長侵襲轉移機制,認為Twist能夠促進SKOV3細胞VM和EMT的形成,從而增強SKOV3細胞的侵襲轉移能力,SKOV3細胞發生VM及EMT的具體機制以及內在的時間點和表達模式的關聯仍有待進一步研究。