基于納米磷脂盤包被CD44v6的特異性多肽篩選

張 丹,盧桂芳,馮 云,劉亞萍,趙 倩,任牡丹,盧新蘭,和水祥

(西安交通大學第一附屬醫院消化內科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:dyyyjxk@xjtu.edu.cn)

篩選腫瘤標志物的特異性配體是實現腫瘤靶向診斷以及治療的重要措施。目前針對腫瘤分子影像的顯像方法如PETCT/SPETCT、光學成像、MR和超聲等平臺的研究已獲得重大的突破,但開發獲取高靈敏性、特異性、親和力的分子探針,是這項研究的難點與重點[1,2]。CD44是比較重要的腫瘤標志物,針對該蛋白的靶向藥物開發已有報道。CD44v6是CD44中腫瘤特異性、靈敏性均較高的結構域。曾有針對此結構域的單克隆抗體藥物進入了臨床試驗階段,但因致死性副反應被中斷試驗[3]。相對于抗體類配體,多肽配體具有更小的分子量,因此免疫原性及毒性也相對較低[1],因此本研究致力于開發此類配體。而目前國內外尚無針對CD44v6的配體多肽報道。

噬菌體展示肽庫是獲得特異性親和多肽的高通量篩選方法。本課題組前期使用噬菌體多肽展示技術分別篩選了重組蛋白、細胞、癌組織,結果表明利用細胞、組織篩選的多肽藥物具體靶點分子不易明確,蛋白篩選的過程中其高級結構及活性形式難以保持,影響探針的親和力及特異性[4-7]。而近來出現的納米磷脂盤技術可以在體外模擬膜蛋白在細胞膜的磷脂雙分子層結構中的活性結構[8]。本研究對CD44蛋白進行Nanodisc包被,改良傳統噬菌體展示肽庫篩選方法,篩選并驗證了CD44v6特異性配體多肽序列。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑

人胃癌SGC-7901細胞(中國科學院上海細胞庫),人胚腎HEK-293細胞(美國菌種保藏中心)。真核來源的CD44v3-v10重組蛋白(OriGene,美國),噬菌體展示12肽庫(New England Biolabs,美國),His-MSP蛋白(Cube Biotech,德國),抗CD44v6單克隆抗體(北京鼎國昌盛公司),抗M13噬菌體抗衣殼蛋白多克隆抗體(Santa Cruz,美國),HRP標記兔抗山羊抗體(北京博奧森公司),TMB顯色試劑盒(北京博奧森公司)。

1.2 CD44v3-v10蛋白的Nanodiscs組裝及檢測

將137 μl的100 mmol/L膽酸鈉溶液(溶于20 mmol/L Tris，pH 7.4)與4.65 mg二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)混合，37 ℃搖動孵育30 min。將His-MSP蛋白溶于ddH2O中(2 mg/ml,W/V)，CD44v3-v10蛋白(2 mg/ml,W/V)溶于緩沖液20 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl(pH 7.4)，與等體積100 mmol/L膽酸鈉混合。500 μl混合物與DMPC溶液混合，4 ℃、37 ℃交替孵育，每次20 min，共孵育2 h。使用3-8 kD孔徑透析管4 ℃透析48 h，期間更換透析液4次。

采用分子排阻色譜鑒定,色譜柱為SuperdexTM200 Increase 10/300 GL分子排阻預裝柱(GE,美國),流動相為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液含0.15 mol/L NaCl(pH 7.0),流速0.5 ml/min,上樣量25 μl。

采用SDS-PAGE檢測,25 μl樣品與5 μl 6×SDS-PAGE上樣緩沖液混合,煮沸5 min,加入10%分離膠與5%濃縮膠所制膠板,SDS-PAGE分離蛋白,考馬斯亮藍染色。

1.3 噬菌體展示肽庫篩選

陰性篩選：1% BSA(W/V)溶于0.84% NaHCO3(W/V，pH 8.4)，4 ℃過夜，包被至酶標板，3% BSA(W/V)封阻滿孔2 h。將10 μl噬菌體展示肽庫使用TBS(10 mmol/L Tris，pH 7.4)稀釋至100 μl，加入陰性篩選孔，37 ℃搖動孵育2 h。

陽性篩選：將陰性篩選后未結合噬菌體上清與100 μl Nanodiscs包被CD44v3-v10蛋白混合，加入TBS溶1% BSA(W/V)以及Ni-NTA磁珠(Cube Biotech，德國)，37 ℃搖動孵育2 h。去除未結合噬菌體上清，0.1% TBST(Tween-20 0.1%,W/V)洗滌磁珠6次。磁珠使用單克隆抗CD44v6抗體(15 mg/ml)競爭性洗脫30 min，收集洗脫液。

滴定:將待滴定文庫使用LB液體培養基分別稀釋10-6,10-7,10-8,10-9,10-10稀釋度,分別加入培養至對數前期E.coli ER2738菌液中,混勻后加入3 ml頂層瓊脂糖中,迅速混勻倒至LB/IPTG/Xgal固體培養基平板,37 ℃培養過夜,選擇含有102數量級藍色噬菌斑的平板計數,噬菌體滴度=(噬菌斑數目×稀釋倍數)pfu/10 μl。計算回收率:回收率=回收噬菌體/投入噬菌體。

擴增:將陽性篩選后全部洗脫液加至20 ml對數期E.coliER2738菌液中,37 ℃、225 r/min振蕩培養4.5 h,將培養物離心,每毫升上清中加入200 μl PEG/NaCl沉淀噬菌體,TBS重懸,重復上述沉淀-重懸過程,加入200 μl TBS/0.02%NaN3(W/V)噬菌體保存液,是為次級庫。對次級庫進行滴定。

后續篩選:重復以上過程進行后續篩選,每輪投入噬菌體為上輪篩選所得次級庫,洗滌步驟中TBST根據篩選輪次分別為0.2%,0.3%及0.5%,第四輪篩選洗脫液滴定后不再擴增。

1.4 噬菌體測序

分別從第4輪篩選洗脫物滴定平板隨機挑取30個噬菌體單克隆,分別加入3 ml對數期E.coliER2738菌液,37 ℃、225 r/min振蕩培養4.5 h,將培養物10 000 r/min離心10 min,收取上清,命名為噬菌體單克隆貯液。在貯液500 μl中加入200 μl PEG/NaCl,4 ℃沉淀噬菌體,去除上清,使用碘化物緩沖液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,4 mol/L NaI)重懸,加入250 μl無水乙醇沉淀洗滌DNA,短時間真空干燥,使用30 μl TE緩沖液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)重懸沉淀。使用-96 gⅢ測序引物(5′-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′)行全自動測序(上海生工公司,中國),根據噬菌體多肽展示文庫附帶使用手冊,讀取及翻譯噬菌體測序結果。

1.5 噬菌體ELISA驗證

取噬菌體單克隆貯液,常規擴增、純化、滴定。陽性孔采用CD44v3-v10重組蛋白(1 μg/孔)加入100 μl 0.84% NaHCO3(W/V,pH 8.4),陰性孔采用3%(W/V) BSA,4 ℃過夜包被酶標板,3% BSA封阻滿孔2 h。分別加入待測克隆以及隨機對照克隆(1011pfu/孔),37 ℃孵育1 h,常規洗滌。加入0.1% TBST稀釋的山羊抗M13噬菌體衣殼蛋白多克隆抗體(稀釋度1 ∶1 000,V/V),加入0.1% TBST稀釋的HRP標記兔抗山羊抗體(稀釋度1 ∶5 000,V/V),一二抗均37 ℃孵育1 h,常規洗滌。TMB顯色試劑盒顯色,2 mol/L H2SO4終止反應,酶標儀在波長450 nm處讀取吸光度。

1.6 噬菌體洗脫試驗

分別接種SGC-7901、HEK-293于6孔培養板,待細胞長滿單層。4%多聚甲醛固定液4 ℃固定,3% BSA 37 ℃封閉30 min。每孔加入1011pfu待測噬菌體或隨機對照噬菌體與細胞37 ℃孵育1 h,0.1% TBST洗板6次,加入1 ml甘氨酸-鹽酸洗脫緩沖液(1.5%甘氨酸,0.1%BSA,W/V,pH 2.2),室溫洗脫,150 μl中和緩沖液(12.1%Tris,W/V,pH 9.1)中和,洗脫物采用1.3所述方法滴定。

1.7 統計學分析

統計采用SPSS19.0(SPSS, US),計量數據表示為均數±標準差,組間差異比較采用t檢驗,P<0.05被視為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CD44v3-v10蛋白的Nanodics組裝

對包被后的產物進行SDS-PAGE驗證可以發現,圖1A展示了包被后的左側泳道相較右側出現新增的大分子量條帶,提示已形成Nanodiscs化的CD44v3-v10蛋白。隨后在分子排阻色譜的進一步鑒定中發現,有明確的產物峰形成(見圖1B),在產物峰前較低的峰可能提示了一些非特異性聚體的形成所產生的更大直徑納米盤,或者CD44v3-v10蛋白分子之間胞外段的交聯。在前期預試驗中,通過對反應時間的控制,將非特異峰值控制于最低水平。

圖1 CD44v3-v10蛋白的Nanodiscs組裝檢測Figure 1 Detection of CD44v3-v10 assembled Nanodiscs

2.2 針對Nanodiscs的噬菌體展示

整個篩選過程中包括陰性消減及陽性篩選,增加篩選效力。洗脫目標噬菌體時采用了單克隆抗體的競爭性洗脫,以保證所獲得噬菌體的特異性。整個篩選重復4次用于富集陽性噬菌體,并逐步降低非特異結合噬菌體所占比例。前三輪的洗脫噬菌體在下一輪篩選前均進行擴增,一方面保證篩選的力度及有效性,一方面可以使數量多的噬菌體進行指數級別富集,提高陽性噬菌體的比例。每輪篩選需滴定后計算回收率(產出噬菌體/投入噬菌體)。圖2A為第4輪篩選后102級別噬菌體滴定結果,圖2B提示了四輪篩選的回收率變化,可見隨著篩選進行,回收率逐漸升高,四輪分別為10-7,10-5,10-4,10-3級別,提示陽性噬菌體所占比例逐漸增多以及目標噬菌體的富集效應。

圖2 噬菌體展示的滴定及篩選回收率Figure 2 Phage titer and recovery rates of phage display

第4輪篩選結束后,對隨機的30個噬菌體克隆進行測序分析。根據噬菌體隨機十二肽展示文庫手冊中的方法對測序結果分析,尋找限制性內切酶位點KpnⅠ以及EgalⅠ的酶切位點GGTACC和CGGCCG,從而獲得插入DNA序列,再利用M13噬菌體專屬密碼子表進行翻譯,最終獲得噬菌體所展示的12肽序列。表1展示了所挑選30個噬菌體所攜帶的多肽序列。30個噬菌體克隆共攜帶6條多肽序列,分別命名為:NP-1(HNTPSVRHFYKQ)、NP-2(HNTYVTSFHRNY)、NP-3(WQKPSHIPFNAS)、NP-4(QTALYSKPGPPV)、NP-5(ELYYHNTDIESQ)、NP-6(YHWEAYSTTPIS)。6條序列重復中重復的噬菌體克隆分別為8次、12次、4次、3次、2次、1次。重復次數更多的序列體現出篩選過程中的富集效應,相較重復少的序列親和力可能更好,因此也是后續驗證的重點。經比對發現NP-1和NP-2、NP-2與NP-5分別包含有一個重復的三肽基序HNT,可能是多肽結合于靶蛋白的關鍵氨基酸位點。

表1 噬菌體展示多肽序列及重復情況Table 1 Peptide sequence and repetition frequency of phage display

2.3 親和配體序列的選擇

噬菌體ELISA是用于鑒定噬菌體單克隆的常用方法。為排除結合于Nanodiscs其他成分的噬菌體,選擇固相包被較高量的CD44v3-v10蛋白作為噬菌體結合的靶點。6個待測噬菌體克隆、陰性對照隨機序列克隆(unrelated random phage,Urps)以及空白對照噬菌體溶劑TBS,分別結合于靶蛋白包被孔以及BSA陰性對照孔。評價標準包括噬菌體與靶蛋白結合的吸光度絕對值,還包括噬菌體與靶蛋白、BSA吸光度的比值,分別代表了噬菌體結合的親和性及特異性。圖3A展示了ELISA驗證待測噬菌體及對照噬菌體針對靶蛋白及對照蛋白的檢測結果,可見噬菌體與靶蛋白結合的吸光度絕對值自高到低順序為NP-2、NP-5、NP-1、NP-2、NP-4、NP-3、NP-6,靶蛋白、BSA吸光度的比值自高到低順序與此一致。因此選擇親和性及特異性表現均最好的NP-2、NP-5、NP-1三個序列做進一步的鑒定。

由于本研究以獲取結合于CD44v天然活性形式的配體為主要目的,因此在使用固相包被蛋白確定了特異性噬菌體待測克隆后,繼續選擇了CD44v6不同表達情況的人細胞做進一步結合驗證。圖3B為噬菌體洗脫試驗結果?？梢园l現NP-2、NP-5、NP-1三個克隆均與CD44v6陽性細胞SGC-7901結合更多,結合噬菌體計數高于其與CD44v6陰性細胞HEK-293的結合噬菌體數(P<0.05),也高于無關隨機對照克隆在SGC-7901細胞上的結合數量(P<0.05)。3個克隆中,NP-2、NP-1的結合噬菌體為107數量級,而NP-5僅為105數量級。此外,NP-2與陰性細胞結合噬菌體僅為105數量級,而NP-1與陰性細胞結合噬菌體為106數量級。從結合力、選擇性兩方面綜合考慮,NP-2為此次篩選獲得的最優序列。

Urps:隨機無關克隆;TBS:空白對照圖3 待選噬菌體克隆的鑒定Figure 3 Identification of canditate phages

3 討論

CD44是多種重要的腫瘤標記物,現有報道支持了其與腫瘤的相關性。CD44作為細胞黏附分子,可以促進細胞與細胞外基質的黏附,調節細胞運動功能,調節細胞偽足形成以及其遷移運動[9]。CD44的不同剪切表達以及與透明質酸等配體的結合在腫瘤的發生發展中起到了重要的作用[10]。CD44與腫瘤的關系主要包括促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡、以及促進腫瘤侵襲遷移等方面[11-14]。

在已知藥物的靶點蛋白中,大多數為膜蛋白,因其定位于細胞膜性結構,避免了細胞外分泌蛋白對探針定位的干擾,而且以胞外段為靶點也無需探針具備穿膜特性。CD44分子是跨膜糖蛋白,包含有胞外段,跨膜段以及胞內段3個部分,胞外段所占分子量最大,是理想的藥物靶點。但CD44胞外段存在多種剪切表達結構,構成多種轉錄變異體。其中包含有變異型外顯子編碼區的CD44分子在普通細胞及腫瘤細胞間具有最明顯的表達差異,具有最好的腫瘤特異性[15]。其中, CD44v6的腫瘤靈敏性及特異性最為理想,因此也成為靶向藥物研發的熱點,其單克隆抗體比伐珠單抗(bivatuzumab)在頭頸部腫瘤的治療中已進入臨床試驗階段,但卻因抗體藥物引發的致死性毒副反應被終止研究[3]。

傳統的常用的靶向藥物包括抗體類、小分子類。但抗體分子量大,免疫原性過高,成本及運輸儲存條件制約性過大,小分子類易于獲取,但缺乏抗體分子多樣性所帶來的高特異性和高親和力[16]。多肽類藥物是近年研究較多的靶向藥物種類,有著結構多樣、特異性好、代謝快、免疫原性低、價格低廉的多種優勢[16]。

噬菌體展示肽庫是獲得特異性親和多肽的高通量篩選方法。該技術的靶點可以是蛋白、核酸等分子,也可以是細胞、離體或者活體組織[17]。現有報道中,使用細胞、組織篩選的多肽藥物具體的分子靶點多不明確[4,18]。由于細胞、組織表面成分復雜,后續可能需要免疫共沉淀、蛋白組學研究尋找可能的分子靶點,試驗難度相對大,影響因素也比較多[19]。使用重組蛋白,在篩選過程中進行固相包被會損害大分子蛋白的高級結構,難以實現分子在體內的狀態,為日后的應用帶來限制。

CD44是膜蛋白,只有在雙層膜及類脂環境中才能保證活性狀態,體外難以模擬,而在細胞中表達量往往較低,不足以實現嚴格的消減篩選[20]。為了實現對活性膜蛋白的研究,近年出現了磷脂納米盤(Nanodisc)技術。它是通過在體外模擬細胞膜的磷脂雙分子層結構,使用高密度脂蛋白中的ApoA-1蛋白改造形成膜腳手架蛋白(MSP),該蛋白可以包裹磷脂雙分子形成類膜結構,靶點膜蛋白可以組裝于這種類膜結構上以獲得其活性形式[8]。

膜蛋白的Nanodics組裝包括3個要點,首先是膜蛋白的獲取,然后是蛋白、磷脂、骨架蛋白的包被比例及條件,最后是對包被結果進行驗證。由于膜蛋白的分離純化較為復雜,難以獲得單一蛋白,因此擬以重組蛋白作為靶蛋白。CD44v3-v10 (NP 001001389.1) 蛋白是已知天然人源性CD44中,包含全部腫瘤相關結構域的異構體,其cDNA也可以實現常規文庫的釣取。在重組蛋白的載體選擇中,優先選取了人源性細胞作為表達來源,因其可提供最接近于自然狀態下的CD44形態及高級結構,提高后續篩選配體在實際應用中的親和力及特異性。

Nanodisc通過MSP蛋白包裹磷脂雙分子形成類膜結構,靶點膜蛋白可以組裝于這種類膜結構上以獲得其活性形式。其中膜蛋白與MSP蛋白的比值最為重要。為避免多個膜蛋白結合于一個Nanodiscs或膜蛋白分子之間發生非特異性結合,本研究采取過量MSP蛋白,這也是大多數研究采取的方法[8]。而MSP蛋白與磷脂的投入比相對固定。本研究采用了商品化的Nanodiscs 試劑盒,可提供既定的MSP及磷脂投放量。

噬菌體展示可以實現對固相及液相靶蛋白的篩選,固相包被相對需要的靶蛋白量較多,且不利于Nanodiscs中膜蛋白高級結構的充分展示,因此本研究選擇了液相篩選方法。為實現目標噬菌體的收集,靶蛋白包被時采用了His-tag-MSP蛋白,篩選時可利用Ni-NTA 磁珠進行特異性吸附。在每輪篩選前,噬菌體隨機肽庫需要與BSA進行非特異性結合,以消減篩選的形式減少非特異性吸附的產生。陽性篩選過程通過逐漸增加強度的洗滌除去親和力不足的噬菌體。在獲取結合噬菌體時采取CD44v6單克隆抗體的競爭性洗脫。以保證獲取噬菌體均結合于該抗原決定簇。

在對CD44v3-v10蛋白包被后,使用了SDS-PAGE及分子排阻色譜雙重鑒定。兩種驗證均提示大量產物形成,因此可以考慮進行下一步的篩選。在噬菌體展示篩選過程中,可以發現第1輪回收率僅10-7級別,有較強的篩選力度,而后回收率逐輪上升,第4輪上升至10-3級別,提示了有效噬菌體在每輪次級庫中的比例逐漸升高。對獲取克隆的測序發現,待選噬菌體出現了比較明顯的富集現象,30個克隆僅攜帶6條序列,重復最高的序列占所有克隆的40%。其中兩條序列還出現了相同的三肽基序,證明篩選的有效性,而這個三肽基序則可能是整條多肽結合的關鍵位點。

為了排除結合于Nanodisc其他成分的噬菌體,噬菌體ELISA檢驗中僅使用靶蛋白而非組裝好的Nanodisc。檢驗發現,陽性克隆結合于靶蛋白明顯高于對照蛋白,也高于對照克隆,證明所篩選的陽性克隆對靶蛋白的特異性。而經過綜合考慮每個克隆與靶蛋白結合的OD值,以及與對照蛋白結合的情況,對待選噬菌體進行了初篩,排除部分結合較低或特異性差的噬菌體。繼而待測克隆還需結合于細胞水平表達的靶蛋白,以確定噬菌體與靶蛋白活性形式的結合力及特異性。噬菌體細胞洗脫試驗也證實了幾個待測克隆對靶蛋白腫瘤細胞以及靶蛋白陰性細胞的結合。NP-2噬菌體因其結合力及結合特異性被選擇為最佳序列。后續工作會將篩選獲得的多肽序列進一步合成探針,檢驗其體內外與靶蛋白、靶細胞的結合,為CD44v6陽性腫瘤的靶向診斷及靶向治療提供方法和臨床前期基礎。