宮頸病變病理診斷中P16及ki67的運用

張曉野，于冉冉，郭海燕

(山東中醫藥大學第二附屬醫院病理科，山東 濟南)

0 引言

宮頸癌是一種對女性健康存在嚴重威脅的惡性腫瘤性疾病，在其篩查過程中，宮頸組織活檢病理直接關系到患者的處理方式。宮頸癌疾病中的原位癌多發于30～35歲女性，而浸潤癌多發于45～55歲女性，近幾年，該病年輕化趨勢也日益明顯。宮頸癌按級別不同給予不同的診斷與治療方法，其中低級別鱗狀上皮病變(LSIL)以下患者需進行定期復查；而高級別鱗狀上皮病變(HSIL)以上患者，按患者病情需給予leep刀或宮頸錐切。為避免因組織學假陽、假陰性結果而出現過度或延誤患者治療情況，加強對宮頸病變組織學本質的準確識別具有重要作用。

據國外多個研究結果[1-2]顯示：不同病理醫師進行單獨宮頸活檢組織常規HE切片時，對患者宮頸病變的診斷不僅差異較大，還存在較低的重復性，Kappa值在0.2～0.5之間，呈低中度。對于部分難以診斷的病例，臨床多數采用由多個病理醫師進行分別診斷，最后以討論的方式得出一個一致性診斷意見。但部分基層醫院由于缺乏病理醫師，當無確切診斷結果時，需進行會診，而這種會診不僅耽誤了患者的治療時間，還增加了病人的花費。因此，為減輕患者經濟負擔，不耽誤患者病情，通過可靠、客觀的指標增強病理醫師對患者疾病的準確診斷是至關重要的。

由研究結果[3-4]可知：高級別鱗狀上皮病變(HSIL)與P16及Ki67的強表達存在較為密切的關系。本文為提高病理醫師對宮頸癌上皮病變診斷的準確性，運用P16與Ki67，并分析其臨床診斷意義。

1 材料與方法

1.1 材料

在我科室自2017年1月至2018年6月進行的宮頸活檢病例中進行搜集，參與活檢的組織均固定于中性福爾馬林中，由德國Leica公司生產的ASP200脫水機對活檢組織進行脫水、透明及浸蠟處理，石蠟包埋后，對常規石蠟HE與免疫組織進行化學切片，切片厚度為3μm。

納入標準：所有活檢病例均使用陰道鏡下宮頸活檢標本；參與本次實驗的活檢組織均由中性福爾馬林予以固定；所選病例均不不包括浸潤性鱗癌、合并其他腫瘤及腺上皮病變患者；排除標準：排除活檢組織病灶太小、無法進行重新連續切片及活檢組織中無鱗狀上皮的病例；排除由2名副主任級別以上病理醫師通過閱片無法形成一致性意見的活檢組織常規HE切片病例。我科室通過篩選，從眾多病例中抽選出207例病例，其中正常病例為114例，低級別鱗狀上皮病變(LSIL)37例，高級別鱗狀上皮病變(HSIL)56例。

1.2 方法

由我科室4名病理醫師依據TBS診斷系統對207例病例通過常規HE染色與P16，Ki67免疫組織化學染色進行2次診斷，診斷主要分為正常、低級別鱗狀上皮病變(LSIL)及高級別鱗狀上皮病變(HSIL)三種結果。第一次診斷主要由各病理醫師以閱讀常規HE染色切片進行，并對診斷結果進行記錄與統計，對各醫師所作診斷結果進行一致性與符合率計算，其中一致性由Kappa值表示；第二次診斷再次由4名病理醫師在3個月后根據P16、Ki67免疫組織化學切片進行，為獲得診斷一致性，對比各醫師診斷結果，再次對病理醫師的閱片Kappa值、符合率進行計算。最終依據參考標準，對4名醫師的診斷結果進行一致性與符合率比較，并對其統計學意義進行分析。

1.2.1 免疫組織化學染色方法(P16及Ki67)

選用中杉金橋公司提供的P16及Ki67抗體，對P16與Ki67分別應用10與K2的克隆號進行手工染色，選取顯色為ER2，DAB的抗原修復液進行蘇木精復染，對免疫組織化學染色按批次不同分別設置陽性與陰性對照。P16與Ki67免疫組織化學陽性結果判讀依據分別為：1)病變上皮大于中下一半范圍，呈彌漫連續棕黃色表達；2)病變上皮中表層呈彌漫性棕黃色表達，P16陽性表達部位為胞漿及細胞核；Ki67陽性表達部位為細胞核。

表1 常規HE切片與P16及Ki67免疫組織化學染色診斷對比表(n,%)

表2 以參考標準為依據，比較病理醫師診斷結果一致性

1.2.2 參考標準

將經2名副主任以上級別醫師閱片所得的一致性診斷結果作為臨床參考標準。

1.3 統計學處理

所有診斷數據均由SPSS 19.0軟件進行統計與分析。診斷結果一致性的判斷方法主要是通過Kappa檢驗完成，以Malpica等[5]為依據，根據Kappa值，將其分為弱、中、高與極強四個級別，其中Kappa值低于0.4為弱；Kappa值在 0.4～0.6范圍內為中度；Kappa值在0.6～0.8為高度；Kappa值在0.8～1.0范圍內為極強。符合率與參考標準等指標均由計數(n，%)與計量()資料表示，組間行χ2與t檢驗，當P＜0.05時，組間差異存在統計學意義，其中符合率公式為：診斷符合例數/總數×100%。

2 結果

2.1 對比各病理醫師診斷結果的一致性

不同病理醫師進行單獨宮頸活檢組織常規HE切片時，對患者宮頸病變的診斷不僅差異較大(0.259≤ Kappa值≤ 0.480，0.343±0.138)，呈弱至中等一致性，符合率較低( 55%～70% )。第二次閱片于3個月后進行，除進行常規HE切片外，還給予P16及Ki67免疫組織化學染色診斷，病理醫師診斷結果一致性與符合率均較第一次有明顯提升，Kappa值：(0.648≤Kappa值≤ 0.804，0.707±0.098)，符合率升高至 78%～88%，P＜0.05(見表 1)。

2.2 以參考標準為依據，比較病理醫師診斷結果一致性

不同病理醫師進行單獨宮頸活檢組織常規HE切片時，對患者宮頸病變的診斷不僅差異較大 (0.344≤ Kappa值≤ 0.458，0.431±0.040)，呈弱至中等一致性，符合率為60%～65%，明顯較低。第二次閱片于3個月后進行，除進行常規HE切片外，還給予P16及Ki67免疫組織化學染色診斷，參考標準與醫師診斷一致性較第一次閱片結果，均存在顯著提高，Kappa值：(0.739 ≤ Kappa值 ≤ 0.853， 0.799±0.055)，符合率提升至85%～91%，P＜0.05。

3 討論

作為一種僅次于乳腺癌的惡性腫瘤疾病[6]，宮頸癌的發病率已位居女性惡性腫瘤疾病的第二名，對女性的身體健康與生命安全存在嚴重威脅。宮頸活檢病理診斷對宮頸癌疾病的預防與治療意義較為重大，其活檢結果不僅可為醫生進行進一步診斷提供正確的指導，其病理結果還方便醫生為患者制定下一階段的臨床診療方案。由近些年國外的相關研究結果[7-8]可知，病理醫師對宮頸病變病理僅進行常規HE切片診斷時，其重復性僅表現為中度，但在常規HE切片診斷基礎上，添加P16及Ki67免疫組織化學染色，其診斷一致性與則呈高度與極強重復性。從宋建明等[9]關于宮頸非典型不成熟化生與其類型病變診斷結果一致性的探討可知，不成熟化生和CINIII經不同評估者進行診斷，其診斷結果一致性較高，而非典型性不成熟化生、濕疣、CINI和CINII的精不同評估者進行診斷，其診斷結果一致性卻并不高，甚至可以用較差來形容，但對于兩者之間的解決方案，作者卻并未予以闡述。基層醫院受我國醫療體系建制問題影響，其病理可診斷力量相對薄弱，無法有效保障其病理診斷準確性。為提升基層醫院病理科對宮頸病變病例的臨床診斷準確性，增強相關客觀輔助診斷指標的尋找對提升該疾病的診斷結果的一致性具有重要意義。作為一種與高危型人乳頭狀瘤病毒感染存在密切關聯的細胞周期依賴激酶抑制因子，其癌基因蛋白E7滅活細胞因對Rb蛋白具有調控作用，易使P16出現過表達。由研究結果[10-11]發現：作為一種效果理想的預后觀察指標，P16的過表達與高級別鱗狀上皮病變(HSIL)與存在較為密切的關系。而Ki67表達范圍較為明顯，可表達于除G0期外的任何細胞增殖周期，其中正常宮頸上皮中的Ki67對基底層及副基底層細胞均可表達，宮頸病變中Ki67的表現也較為明顯，一般為全層鱗狀上皮彌漫陽性表達[8]。隨P16與Ki67免疫組織化學指標在臨床的廣泛應用，其對我國病理醫師提升宮頸病變診斷結果一致性具有重要作用。

綜上所述，病理醫師在進行單獨常規HE切片診斷時，其所得到的診斷結果與參考標準的一致性主要呈弱至中度，且符合率均較低，但隨P16及Ki67免疫組織化學染色的加入，醫師診斷結果與參考標準一致性逐漸提升至高度至極強，符合率也隨之大幅度提升。由此可知，在常規HE切片檢測基礎上，添加P16及Ki67免疫組織化學染色檢驗，不僅提升了宮頸活檢病變的診斷準確率，還提升了P16及Ki67兩個指標對宮頸病變診斷的輔助作用，增加了宮頸病變病理結果的可靠性，為醫生提供進一步治療提供科學依據。