富油微藻分離鑒定技術研究進展

王天強，周林宗，王紫荊，王江鵬，王子敬，張 偉，田海燕

（楚雄師范學院，云南 楚雄 675000）

隨著人類社會、經濟的發展，人口數量的增多，能源需求量也愈來愈大。煤、石油、天然氣作為不可再生的化石能源，大部分已被開采。能源短缺、急切需要加快尋找綠色清潔能源的步伐。生物柴油是新型清潔能源，不會像化石燃料一樣面臨枯竭，且燃燒后對環境的污染小。目前世界各國把目光聚集在生物柴油的研發上，生物柴油勢必將成為新能源開發的新趨勢［1］。

生物柴油是通過動物、植物體油脂等和醇類在酸或堿催化劑下反應得到［2］。傳統油料作物因其產量低、成本高、與農作物爭地、受季節性影響高等缺點不宜大規模應用。微藻是一種生長在自然水體和土壤中的單細胞生物，生長迅速、繁殖快、可以利用污水內成分生長，是理想的生物柴油替代品［3］。

1 微藻研究發展歷程

直到目前為止，自從微藻生物能源概念的提出和發展，微藻已成為污水處理行業的熱門研究對象，在微藻工藝、設備、及機理方面已有許多成果。

1）微藻研究發展歷程。美國麻省理工學院的研究學者于1950年在校園內建筑物的屋頂開始進行養殖藻類生產生物燃料的試驗，并在研究中第一次提到微藻生物能源概念；之后，Oswald等1957年提出了利用微藻來處理污水中的氮磷等營養物質［4］，這為藻類應用于污水處理奠定了基礎。Mcgriff等在1971年提出了“活性藻”的概念，顧名思義，把活性污泥和藻相結合，然后微藻處理污水的方式便和活性污泥處理污水的方式相同，結果表明，這種方式可以去除污水中92%的氮和94%的磷［5］。受第一次石油危機的影響，美國能源部可再生能源國家實驗室于1978年啟動了水生物種項目研究，該項目歷時19年、耗資2505萬美元，且項目篩選出300余種產油藻種，重點開發適于微藻生物柴油生產的培養系統和制備工藝。直至20世紀90年代，日本國際貿易和工業部投資資金25億美元，用于支持 “地球研究更新技術計劃”，著力開發密閉光合生物反應器技術，利用微藻吸收火力發電廠煙氣中的二氧化碳，將之轉化為有機能源生物能源；90年代后期油價大幅下降，微藻能源研究處于停滯狀態。21世紀以來微藻以其獨特的優勢，重新成為研究的熱點，并作為污水處理及能源行業研究的重點。

2）微藻利用研究。20世紀50年代以來，國內外研究學者證明了微藻是海洋中的主要初級生產者，是海洋生態系統和食物鏈的基礎，且驅動著整個海洋生態系統的能量流動和物質循環，在海洋生態系統的物質循環中起著不可替代的作用。如Tam等利用小球藻對模擬生活污水進行脫氮除磷處理，結果表明，懸浮態小球藻對氮磷的去除率分別為40%和59%，而固定態小球藻對這兩種物質的去除率達到了78%和94%［6］。此外，有研究表明固定化藻類可以回收污水中的重金屬，如Cu2+、Zn2+、Hg2+、Au3+等離子［7］。

微藻凈化污水具有較好的效果，目前對微藻凈化污水的機理的研究也較多，主要從脫氮除磷和吸附重金屬兩方面進行研究。污水中的各種含氮化合物是微藻自身生長繁殖所需的氮源，CO2和碳酸鹽等無機物作為碳源，在光照作用下進行自養生長，微藻吸收轉化后的化學物質用于合成微藻自身的氨基酸、蛋白質、其他細胞結構等［8-9］。

2005年，隨著生物能源發展，國外第一輛采用海藻燃料和大豆油（調合體積比為1∶9）為能源的示范轎車在印度完成實驗，并實現了1500km的里程，打開微藻生物能源在交通運輸中的開端。緊跟腳步，2007年美國國際能源公司啟動了“海藻變油”的研發計劃，通過海藻的光合作用來生產可再生柴油和噴氣燃料。而應用于航天的生物柴油，也隨著Solazyme等人利用異養法養殖高含油微藻研究變為現實。

3）微藻利用機理研究。污水中的磷酸鹽可以通過直接吸收或通過磷酸化途徑轉化成ATP，或者以磷酸鹽的形式沉淀［10］。微藻的培養不僅僅是培養出生長速度快，環境適應能力強的微藻，更重要的是對微藻工程利用的機理加以探索，實現微藻的污水生物處理，體現理想的經濟、環境和社會效益。目前對于微藻的誘變、選育以及產脂性能研究方面關注度較高，并且成果顯著［11］。

4）我國微藻固碳研究與生物能源技術研究較之國外起步較晚，但后期厚積爆發，取得不菲的成績。目前，在高產油藻種的選育與改造、高效微藻光反應器、高密度培養、高效加工等技術研究［12］方面有了顯著進步。

目前，微藻在分子生物學研究、污水處理工藝研究、脂肪積累機理等研究方面關注度較高，研究成果豐富。但是隨著環境問題的突出，是否導致微藻資源的變化，如種類和數量方面的變化，該方向值得深入研究。另一方面微藻資源的調查分析與種質資源保存方面研究具有重大意義，種質資源的保存有助于我們了解環境變化對生物的影響，為未來微藻研究積累資源。

2 微藻分離技術及流程

微藻分離指的是通過環境取樣，采集含有微藻的樣品（如水樣、土壤樣品等），通過適宜的培養基，經過前期微藻富集增加微藻數量，再進行微藻的分離工作，最終獲得純種微藻的過程。

2.1 微藻樣品采集

微藻種類繁多，適用能力極強，水環境中的淡水和咸水，以及土壤環境（一般土壤和沙漠土壤）均有微藻的分布，不同環境內微藻樣品采集方式有所差異。

1）水環境微藻樣品的采集。淡水環境微藻水樣采集常用分層取樣的形式，采用水質取樣器采集不同深度水樣，水樣采集后存放于無菌采樣瓶中［13］，現場測定溫度等部分水樣常規指標，其他指標帶回實驗室測定。海水樣品的采集主要指海洋水樣的采集，采集后置于采樣瓶中帶回實驗室進行后續試驗［14］。水環境樣品采集時除了采集水樣外，水體沉積物也需進行采樣，如湖泊沉積物、海洋底泥等，用采樣鏟子將樣品標本收集于取樣袋內，帶回進行微藻的分離培養。

2）土壤環境微藻樣品的采集。選取環境中含微藻的取樣點，用鏟子小心采集土壤表面層及其至10cm深處土壤，沙漠土壤樣品采集帶回實驗室后直接用于后續分離培養試驗［15］，收集于密封袋中帶回實驗室的樣品，可在黑暗、室溫條件下保存［16］。

2.2 微藻培養基選擇

由于采集帶回實驗室的樣品內含有多種微生物，如細菌、真菌、原生動物等，快速、定向富集微藻需要優選適宜的培養基，常見的培養基有SE培養基、BG11培養基、f／2培養基、D1培養基、BBM培養基、TAP培養基和MA培養基，各培養基用途及適宜微藻類型如表1。

表1 微藻分離常用培養基

培養基為微藻的生長提供碳源、氮源、水和各類無機生長因子，因此在對未知微藻進行分離培養時，可對培養基的成分進行適當調整，以適應微藻研究需求。

這種突破性貢獻，也讓她個人取得無上殊榮——成為人類歷史上第一個兩度獲得諾貝爾獎的人，各種獎金與頭銜更是不勝枚舉。

2.3 微藻富集過程

微藻富集指的是利用適宜培養基，將采集微藻樣品接種于培養基內，一方面快速增加微藻數量，另一方面抑制其他生物的生長。常見加速富集速率的方法有樣品預處理、培養基的優化［21］、抑菌方案的篩選［22］和培養條件設計。

采集回實驗室的樣品首先進行微藻的顯微鏡檢測，若微藻數量較高，則直接進行微藻分離，否則將采取富集培養的方式。在富集培養之前，需對水樣進行預處理，如去除大的砂石和土壤顆粒、水樣進行初步過濾，去除非目標生物等。

培養基優化，淡水培養基常用BG11和SE，但是培養基的pH值和培養條件可進行優化，甚至可在培養基內加入土壤浸提液或者原位滅菌的水樣。如響應曲面法優化后的BG11培養基適宜于養豬廢水內刺鏈帶藻的生長［23］，研究學者優化后的培養基可作為微藻富集分離培養基。

抑菌方案的設計，抑菌方案主要通過培養基設計，如培養基內缺少C源且光照培養可定向培養光能自養微藻，進行黑暗培養條件下培養能夠篩選異養生長的微藻，寡異養培養基可抑制大部分微生物的生長，加入抗生素可抑制微生物的同時定向篩選微藻［22］。

微藻培養條件的不同，將微藻培養方式分為光照培養和黑暗培養，不同微藻的生長類型不同，需要進行相應調整。常見微藻培養條件為21～25℃、光暗周期為 12h，如月牙藻［24］、小球藻［25］和柵藻［26］等的培養。除此以外，光暗比 14∶10 h、16∶8 h、全光照和無光照［22］等條件也在微藻篩選中被應用。培養至富集微藻液體顏色發生顯著變化時，取部分樣品進行顯微鏡檢測，目標微藻成為優勢藻并且達到分離濃度即可進入下一步微藻分離的過程。

2.4 微藻分離技術

2.4.1 平板分離技術

微藻培養過程中若改變pH條件，以及減小凝固劑對微藻的影響，可將瓊脂換為結冷膠，以提高純化效果。另外，在純化過程中，為了適用不同微藻類群，也可采取半固體培養基進行微藻的分離試驗。

2.4.2 細胞培養板分離技術

該方法原理為稀釋分離法，將微藻富集液稀釋至適宜濃度，直至每一份樣品內僅含有單個微藻細胞時，對單個微藻細胞進行培養。如微藻細胞培養板分離技術，該方法將富集藻液進行稀釋，稀釋至1～10滴稀釋液內僅含有一個微藻細胞為止，然后在96孔細胞培養板每個培養孔內加入1滴稀釋液，并再加入無菌培養液，放置于培養箱內培養，培養7d后用倒置顯微鏡觀察微藻生長情況，用無菌滴管吸出藻液進行擴大培養，即可獲得純種微藻藻株。

2.4.3 單細胞吸取技術

該方法通過一定的儀器和設備直接取出富集液內的特定微藻細胞，對單個細胞進行獨立培養，常見的有顯微操作技術，流式細胞儀技術。顯微操作技術指的是在顯微鏡下找到單個的微藻細胞，用毛細管玻璃針吸取單個細胞，放于培養液內單獨培養，該方法可快速獲取純種微藻細胞。

流式細胞儀輔助技術可以對細胞快速檢測、識別與分選，通過前期對微藻的富集培養，提高微藻數量，然后采用流式細胞儀進行微藻種類的檢測，并實現定向高效分選微藻，獲得純種微藻藻株。

3 微藻鑒定技術

3.1 形態鑒定

前期分離的純種微藻，用接種針挑取少量于載玻片上，加蓋玻片后顯微鏡觀察，在高倍鏡下記錄其顯微形態與顏色。微藻顯微鏡觀察前可采用魯格氏液固定［27］、結晶紫染色［28］等方式讓微藻形態更為明顯。根據觀察到的形態，參考《中國淡水藻類-系統、分類及生態》對微藻進行初步分類鑒定。此外可配合掃描電鏡對微藻細胞表面形態進行觀察，加強顯微鑒定的準確性。

3.2 分子鑒定

分子鑒定技術通過對微藻的18 SrDNA測序和比對，實現種群的鑒定。具體操作方法為：首先將純種高濃度藻液離心收集微藻細胞，采用CTAB、試劑盒等法提取微藻DNA，獲得高純度DNA；其次對微藻18sr DNA設計引物［28］，設計適當的PCR反應程序，對目標片段進行擴增；擴增片段的測序，由序列測序公司完成（如上海生工、華大基因等）；測序完成片段去除兩段無效片段，將中間片段輸入NCBI內進行比對，選取相似性較高的數據庫已知微藻DNA序列，與目標序列采用MEGA等軟件進行聚類分析，分析目標微藻的種群聚類，最終實現微藻的鑒定，若相似性低于97%，則可判斷為新種微藻［28］。

4 富油微藻篩選技術

分離鑒定的微藻需快速檢測其油脂含量，或者從大批量微藻中篩選出富油微藻，采用尼羅紅染色是較為迅速的檢測手段，使用尼羅紅對微藻進行染色，以三油精為標準品，繪制標準曲線，480nm為激發波長，580nm為吸收波長測定熒光值，根據熒光值測定油脂含量［28］，快速篩選富油微藻的尼羅紅染色法、是一種很好的初級篩選方法。此外，總脂含量的索氏提取測定方法［29］、乙酸乙酯／正己烷混合溶劑萃取法［30］，脂肪酸的 GCMs測定方法［31］均能夠對微藻油脂檢測，實現富油微藻的篩選。通過藻種比生長速率、生物量以及油脂含量的測定，建立了優良藻種的綜合評價方法［32］。

5 微藻發展趨勢

隨著國內化石燃料的大量消耗，生物柴油，尤其是微藻生物能源的開發異常迅速。目前對微藻的開發主要集中在富油微藻的篩選與育種、微藻生物柴油的工業生產與開發。在前期微藻篩選階段，由于自然環境微藻資源的豐富性，每年都有新種微藻被發現，甚至部分微藻在人工培養條件下難以獲得純種的藻株。因此，開發新的微藻篩選工藝、新的微藻培養方法、新的微藻保存措施等可有效加速微藻資源的探索與開發。甚至通過微藻資源的調查，將微藻在生物能源、食品、醫療、化妝品、化工等等諸多領域開拓。