lncRNA BLACAT1通過抑制miR-374b-5p促進非小細胞肺癌細胞增殖和轉移

李明如，林貴湖，聶振凱，張凱華

中國航天科工集團七三一醫院 胸外科，北京 100074

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 nt不編碼蛋白質的RNA，研究發現其在生物表觀遺傳調控過程中扮演重要角色[1]。癌癥的許多基因突變存在于不編碼蛋白質的區域內，lncRNA的異常表達與不同的癌癥類型有關[2-4]。BLACAT1是一種lncRNA，最早發現在膀胱癌中高表達，與腫瘤的發生、發展、增殖及轉移密切相關[5]。研究表明BLACAT1在非小細胞肺癌組織和細胞中高表達，并調節周期蛋白D1/CDKN2B軸抑制非小細胞肺癌細胞增殖[6]。BLACAT1也可以作為海綿吸附miRNA，從而影響miRNA的表達量及生物學功能。BLACAT1通過靶向miR-361促進ABCB1蛋白的表達，加速了胃癌對奧沙利鉑的耐藥，為胃癌的耐藥研究提供了新的思路[7]。

在此，我們圍繞BLACAT1的生物學功能，通過小干擾BLACAT1（si-BLACAT1）降低BLACAT1的表達量，研究對非小細胞肺癌細胞增殖和轉移的影響；并且，通過軟件預測BLACAT1相互作用的miRNA為miR-374b-5p；結合BLACAT1與miR-374b-5p探討其對非小細胞肺癌細胞增殖和轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人非小細胞肺癌細胞A549、HCC827、NCIH1299、NCI-H23和正常肺上皮細胞BEAS-2B購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；DMEM培養基、RPMI1640培養基和胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；谷氨酰胺和100 mmol/L丙酮酸鈉溶液購自Invitrogen公司；CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自日本東仁化學公司；Transwell購自 Corning Costar公司；si-BLACAT1、si-NC 和miR-374b-5p mimics（模擬物）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和SYBR Green試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物、LipofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；MMP-2抗體、MMP-9抗體、E鈣黏蛋白抗體、N鈣黏蛋白抗體和二抗均購自Abcam公司。

1.2 肺癌中BLACAT1的組織表達分析

采用starBase泛癌癥平臺挖掘癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據，分析肺癌組織與癌旁組織中BLACAT1的表達差異。

1.3 細胞培養

人非小細胞肺癌細胞株A549和正常肺上皮細胞株BEAS-2B采用DMEM培養基與FBS體積比為9∶1的完全培養基培養；人非小細胞肺癌細胞 HCC827、NCI-H1299和 NCI-H23采用 RPMI 1640培養基、FBS、谷氨酰胺、100 mmol/L丙酮酸鈉溶液的體積比為88∶10∶1∶1的完全培養基培養。所有細胞均在5% CO2、37℃培養箱中生長，選擇對數生長期細胞進行后續實驗。

1.4 RNA提取和逆轉錄

用總RNA提取試劑盒提取細胞RNA，Nano?Drop檢測純度；用逆轉錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存備用。miR-374b-5p的逆轉錄引物為5'-GT CGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCA CTGGATACGACCACTTAG-3'。

1.5 qRT-PCR檢測

采用SYBR Green染料法檢測各細胞系中BLACAT1和miR-374b-5p的轉錄水平，qRT-PCR檢測儀檢測結果。根據NCBI官網公布的序列設計引物。BLACAT1正向引物為5'-ATCCCTGGA GGAAGTCGTCA-3'，反向引物為5'-CCCACGAGG AAAACCCTTGA-3'；miR-374b-5p正向引物為5'-ATATAATACAACCTG-3'，反向引物為5'-TGAGG TGCTGTGCGTGAC-3'；GAPDH正向引物為5'-GA AGGTGAAGGTCGGAGT-3'，反向引物為5'-GAA GATGGTGATGGGATTTC-3'；U6正向引物為5'-C TCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物為5'-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.6 細胞轉染與細胞活力檢測

將細胞以1×104/孔接種到6孔板中培養，當細胞覆蓋度達50%～60%時，用LipofectAMINE 2000分組轉染細胞，培養48 h后進行后續實驗。將分組轉染后的細胞按5×103/孔接種到96孔培養板中培養，待細胞覆蓋率達80%～90%時棄去培養基，PBS洗3次，加入用不含血清培養基稀釋的10% CCK-8反應液，將加入反應液的96孔板于37℃恒溫培養箱中反應40 min，取出96孔板，放入酶標儀中檢測D450nm值。

1.7 細胞遷移和侵襲檢測

Transwell檢測細胞遷移，LipofectAMINE 2000轉染48 h后的細胞按5×104/孔置于上室中，繼續培養24 h，4%多聚甲醛固定后DAPI染細胞核，熒光顯微鏡拍照記錄，細胞遷移數目百分比計算細胞遷移率。侵襲實驗用含基質膠的Transwell上室接種轉染48 h后的細胞1×104/孔，下室加入含10%血清的培養基，繼續培養24 h，4%多聚甲醛固定后DAPI染細胞核，熒光顯微鏡記錄細胞侵襲能力，細胞侵襲數目百分比計算細胞侵襲率。

1.8 雙螢光素酶報告基因實驗

將含miR-374b-5p結合位點的BLACAT1及Mut-BLACAT1插入pmir-GO構建載體，用Lipo?fectAMINE 2000與miR-NC、miR-374b-5p mimics共轉染細胞，48 h后檢測螢火蟲螢光素酶和海參螢光素酶活性。相對螢光素酶活性為螢火蟲螢光素酶活性值/海參螢光素酶活性值。

1.9 轉移相關蛋白表達水平檢測

用胰酶消化轉染處理的細胞，細胞裂解液裂解細胞，離心分離蛋白和細胞碎片，BCA法檢測細胞懸液中的蛋白濃度。樣品中加入上樣緩沖液，于100℃水浴鍋煮10 min，進行電泳實驗。電泳結束后，恒流轉膜2 h。采用5%脫脂奶粉進行蛋白封閉2 h，再與一抗4℃孵育過夜。一抗孵育完成后，加入二抗孵育1 h，最后加入ECL化學發光液，通過凝膠成像儀觀察蛋白條帶結果。

1.10 統計分析

采用GraphPad Prism 7.0對實驗數據進行統計分析，實驗均重復3次及以上，數據平均值用x±s表示，單因素獨立樣本數據比較用t檢驗或單因素方差分析，雙因素2組及以上采用雙因素方差分析，實驗數據均服從正態分布，雙邊分析P<0.05表示有顯著性差異，具有統計學意義（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

2 結果

2.1 BLACAT1在肺癌組織及癌旁組織轉錄水平差異

通過starBase分析BLACAT1在肺腺癌、肺鱗癌與癌旁組織的表達差異，樣本中有526例肺腺癌及59例癌旁組織，以及501例肺鱗癌及49例癌旁組織。結果顯示，BLACAT1在肺腺癌和肺鱗癌組織中的表達量均高于相應癌旁組織（圖1），差異具有統計學意義（P<0.001）。

2.2 BLACAT1在非小細胞肺癌細胞系與正常肺上皮細胞中的轉錄水平差異

通過qRT-PCR檢測BLACAT1在非小細胞肺癌細胞A549、HCC827、NCI-H1299、NCI-H23和正常肺上皮細胞BEAS-2B中的轉錄水平差異，結果見圖2，非小細胞肺癌細胞系中BLACAT1的轉錄水平均明顯高于正常肺上皮細胞BEAS-2B。比較幾組非小細胞肺癌細胞轉錄水平發現，A549細胞的BLACAT1表達量高于另外3組肺癌細胞，差異具有統計學意義（P<0.001）。

圖1 BLACAT1在肺癌組織與癌旁組織中的差異表達

2.3 BLACAT1對非小細胞肺癌細胞活力影響

采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒分析BLACAT1對A549細胞活力的影響，結果見圖3，si-BLACAT1組A549細胞活力相比空白對照組明顯下調，并存在時間效應，差異具有統計學意義（P<0.001）。結果表明敲低BLACAT1表達能明顯抑制A549的細胞活力。

2.4 BLACAT1對非小細胞肺癌細胞遷移和侵襲能力影響

Transwell檢測BLACAT1對A549細胞遷移和侵襲能力的影響，結果見圖4。相比空白對照組，si-BLACAT1組細胞遷移和侵襲細胞數均明顯下調，細胞遷移和侵襲的數量減少，差異具有統計學意義（P<0.001）。結果表明敲低BLACAT1能夠明顯抑制A549細胞遷移和侵襲能力。

2.5 驗證BLACAT1作為海綿吸附miR-374b-5p

圖2 qRT-PCR檢測非小細胞肺癌細胞系

starBase軟件預測的肺癌中與BLACAT1存在相互作用的miRNA為miR-142-5p、miR-374b-5p、miR-378c和miR-20b-5p。qRT-PCR檢測空白對照組、si-NC組和si-BLACAT1組中各miRNA相對mRNA水平（圖5A），結果顯示，相比si-BLACAT1組各miRNA的mRNA水平，miR-374b-5p的mRNA水平明顯上調（P<0.001）。

為了進一步驗證miR-374b-5p是否為BLACAT1海綿吸附的miRNA，采用雙螢光素酶報告基因實驗驗證空白對照組、miR-NC組和miR-374b-5p mimics組中相對螢光素酶活性（圖5B、C），結果顯示WT的miR-374b-5p mimics組相對螢光素酶活性明顯下調，說明BLACAT1作為海綿吸附miR-374b-5p，降低其mRNA水平。

2.6 BLACAT1/miR-374b-5p對非小細胞肺癌細胞活力的影響

采用CCK-8細胞活力檢測試劑盒評價BLACAT1/miR-374b-5p對A549細胞活力的影響，結果見圖6。相比空白對照組，p-BLACAT1組A549細胞活力明顯增加（P<0.001），miR-374b-5p mimics組A549細胞活力明顯降低（P<0.001），差異具有統計學意義。以上結果表明BLACAT1通過抑制miR-374b-5p能夠增加A549細胞活力。

圖3 CCK-8檢測BLACAT1對A549細胞活力的影響

2.7 BLACAT1/miR-374b-5p對非小細胞肺癌細胞遷移和侵襲能力的影響

采用Transwell培養，熒光顯微鏡觀察BLACAT1/miR-374b-5p對A549細胞遷移和侵襲能力的影響（圖7A）。結果表明，相比空白對照組，p-BLACAT1組細胞遷移和侵襲能力均明顯上調，表現為熒光顯微鏡觀察到細胞遷移和侵襲的細胞數增加，差異具有統計學意義（P<0.001）；miR-374b-5p mimics組細胞遷移和侵襲能力均明顯下調，表現為熒光顯微鏡觀察到細胞遷移和侵襲的數量減少，差異具有統計學意義（P<0.001）；p-BLACAT1±miR-374b-5p mimics組細胞遷移和侵襲能力沒有明顯差異。

采用Western印跡檢測與腫瘤轉移相關蛋白的表達水平，結果顯示，與空白對照組相比，p-BLACAT1組細胞MMP-2、MMP-9和N鈣黏蛋白明顯上調，差異具有統計學意義（P<0.001），E鈣黏蛋白的表達沒有明顯差異（P=0.091）；miR-374b-5p mimics組細胞MMP-2、MMP-9和N鈣黏蛋白明顯下調，E鈣黏蛋白的表達明顯上調，差異具有統計學意義（P<0.001）；p-BLACAT1±miR-374b-5p mimics組細胞MMP-2和E鈣黏蛋白沒有明顯差異（P=0.416；P=0.998），MMP-9蛋白和N鈣黏蛋白的表達存在明顯差異（P<0.001；P=0.0017），差異具有統計學意義。

以上結果表明BLACAT1通過抑制miR-374b-5p的表達促進A549細胞遷移和侵襲。

3 討論

圖4 Transwell檢測BLACAT1對A549細胞遷移和侵襲能力的影響

圖5 驗證BLACAT1作為海綿吸附miR-374b-5p

肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率居前，確診的患者往往為癌癥晚期，轉移性強，預后差[8-9]。傳統治療手段如手術、化療和放療治療效果有限，且化療和放療的副作用大，故選擇有效的補助治療手段成為亟待解決的問題[10]。根據細胞來源不同及鏡下細胞形態，可將肺癌分為小細胞癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌為肺癌發病的主要類型，占85%[9]。非小細胞肺癌分為腺癌、鱗癌和大細胞癌[8]。BLACAT1作為一種長鏈非編碼RNA，在肺腺癌及肺鱗癌組織中高度表達。研究發現，BLACAT1可以作為miRNA的靶點，與mRNA競爭性結合相應miRNA，從而降低miRNA的轉錄水平，提高該miRNA靶基因mRNA的轉錄及蛋白表達水平[7]。

圖6 CCK-8檢測BLACAT1/miR-374b-5p對A549細胞活力的影響

本研究目的為探究BLACAT1在非小細胞肺癌細胞系中的生物功能。體外培養非小細胞肺癌細胞系，篩選BLACAT1高表達細胞系A549，研究BLACAT1對A549細胞增殖和轉移的影響。為了進一步探討BLACAT1的生物功能機制，利用軟件預測BLACAT1作為海綿吸附的miRNA，并驗證預測結果，將BLACAT1與相互作用的miR-374b-5p結合，研究BLACAT1/miR-374b-5p對A549細胞增殖和轉移的影響。最終證實BLACAT1通過抑制miR-374b-5p促進非小細胞肺癌A549細胞的增殖和轉移。miR-374b-5p作為miRNA家族一員，在人類腫瘤中被認為是一種抑癌基因[11-13]。已有研究表明，miR-374b-5p表達下調與癌細胞耐藥相關，例如miR-374b-5p在功能上抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和上皮-間充質轉化（EMT），并且增強細胞對順鉑的敏感性[11]。miR-374b-5p被發現在胰腺癌組織中的表達與癌旁正常組織相比顯著降低，miR-374b-5p上調可改善胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性，并靶向多種抗凋亡蛋白，誘導胰腺癌細胞凋亡的發生[14]。

圖7 BLACAT1/miR-374b-5p對A549細胞遷移和侵襲能力的影響

MMP-2、MMP-9、E鈣黏蛋白和N鈣黏蛋白均被證明與腫瘤細胞的侵襲和轉移相關，其中MMP-2、MMP-9和N鈣黏蛋白為腫瘤細胞轉化為易轉移細胞間質表型的標志物，E鈣黏蛋白為正常細胞表型的標志物，當腫瘤細胞轉變為間質表型時，該蛋白的表達量降低[15-17]。本研究通過Western印跡檢測非小細胞肺癌細胞在BLACAT1作用下，MMP-2、MMP-9和N鈣黏蛋白表達上調，E鈣黏蛋白表達下調；加入miR-374b-5p的回復實驗則上調以上蛋白的表達水平。

綜上，可以將BLACAT1作為非小細胞肺癌治療的新靶點，抑制腫瘤增殖和轉移。