miRNA-30家族在骨肉瘤中的表達及其臨床意義△

成世高，王萬春，蔣棟，李騰飛，李洵，任煉，肖炯哲，康鵬程

1中南大學湘雅二醫院骨科，長沙 410011

2婁底市中心醫院骨科，湖南 婁底 417000

骨肉瘤是一種罕見的惡性間葉細胞腫瘤，具有 高度侵犯性和轉移性，即使利用手術切除結合化學治療，對已有轉移的病患治療后的效果并不理想[1]，目前，對于骨肉瘤的發生和轉移的機制仍未研究清楚[2]。因此，識別和驗證有效的腫瘤特異性標志物用于骨肉瘤早期診斷對提高臨床療效，制訂個性化治療方案有重要臨床意義。

研究發現，微小RNA（microRNA，miRNA）是影響骨肉瘤發展的重要因子，相關miRNA表達情況能夠在一定程度上決定骨肉瘤患者的疾病發展[3]。miRNA是一段長約22～24個核苷酸的單鏈RNA。有學者預測，人類超過30%的基因受到miRNA調控[4-5]。當細胞的生長失去控制或不再具有細胞凋亡的功能時，通常會導致腫瘤的發生。因此，近年來關于miRNA與腫瘤的研究中，重點多在于miRNA對細胞生長和細胞凋亡的調控。miRNA-30家族由5種高度同源的成員組成，即miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-30d 和 miRNA-30e，miRNA-30家族成員在多種腫瘤細胞增殖、分化、遷移和侵襲中發揮重要作用[6-7]。miRNA-30家族成員在不同腫瘤中的作用各不相同，甚至相互沖突，其在腫瘤起始和進展中既發揮抑癌基因又發揮原癌基因的作用。miRNA-30在乳腺癌[6]、卵巢癌[8]、膀胱癌[9]、肝癌[10]、黑色素瘤[11]和皮膚鱗狀細胞癌[12]中發揮抑癌基因的作用。多項研究發現，miRNA-30家族成員在乳腺癌[13]、前列腺癌[14]、肝癌[15]等多種腫瘤中發揮原癌基因作用。miRNA-30家族在不同實體瘤中的作用不同甚至相反，表明miRNA-30在腫瘤發生發展中有多種不同作用，但其機制仍需進一步深入研究。目前，關于miRNA-30家族在骨肉瘤中表達意義的研究較為少見，本研究首先采用熒光實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）檢測5種miRNA-30家族成員在骨肉瘤及相應正常成骨組織中的表達情況，并進一步采用原位雜交實驗檢測熒光實時定量RT-PCR篩選的在骨肉瘤和正常成骨組織中表達有差異的miRNA-30家族成員的表達情況，分析這些miRNA與骨肉瘤患者臨床特征的關系，旨在為骨肉瘤的診治提供新的靶點和思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年1月至2017年12月中南大學湘雅二醫院收治的骨肉瘤患者。納入標準：均經外科手術后標本送檢由臨床病理科診斷確診。依據納入標準，本研究共納入36例骨肉瘤患者，男21例，女15例，年齡6～34歲，平均年齡為（17.2±3.4）歲；失訪4例，隨訪資料完整32例，隨訪時間5～50個月，平均隨訪時間（47.1±3.4）個月；Enneking外科分期：ⅡA期5例，ⅡB期27例；腫瘤部位：股骨9例，脛腓骨14例，其他部位（包括肱骨、頜骨等）9例；分化程度：中高分化17例，低分化15例；肺轉移12例，復發11例。取32例骨肉瘤組織和32例正常骨組織標本。

1.2 實驗方法

1.2.1RT-PCR法檢測miRNA-30家族成員的相對表達量 根據試劑盒說明書，提取骨肉瘤組織的總RNA。實時熒光定量RT-PCR法檢測miRNA-30家族成員 miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-30d和miRNA-30e在骨肉瘤組織中的相對表達量。以U6為內參，設計miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c和miRNA-30d和miRNA-30e的引物（表1），引物設計完成后，BLAST分析引物序列合理性，最后送至深圳華大基因合成。以cDNA為模板，采用鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）反轉錄酶逆轉錄為mRNA，計算目的基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.2.2 原位雜交實驗檢測miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的表達情況 組織芯片脫蠟，于37℃蛋白酶消化15 min，漂洗后梯度乙醇脫水。55℃預雜交30 min后，地高辛標記的miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e探針（100 nmol/L）恒溫雜交1 h，堿性磷酸酶標記的羊抗地高辛抗體室溫孵育1 h，NBT/BCIP黑暗處30℃顯色，核固紅復染。雜交過程選擇U6探針（1 nmol/L）作為陽性對照，去除探針作為陰性對照。結果判定：miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e主要定位于細胞質和細胞核，U6主要定位于細胞核，依據染色強度和陽性細胞所占比例評分：依據染色強度評分，無表達或弱表達計為0分，中等強度或強表達計為1分；根據陽性細胞所占比例，陽性細胞所占比例＜10%計為0分；陽性細胞所占比例≥10%計為1分；將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分相乘，0分表示表達陰性，1分表示表達陽性。所有的操作流程及相關的試劑均根據相關的說明書進行，請兩名副高職稱的病理醫師進行盲閱。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗；miRNA-30家族成員表達與骨肉瘤患者臨床特征的關系采用χ2檢驗分析；骨肉瘤患者預后的影響因素采用Cox回歸分析；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-30家族成員相對表達量的比較

骨肉瘤組織中 miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的相對表達量均明顯低于正常骨組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）。而骨肉瘤組織中miRNA-30b和miRNA-30d的相對表達量與正常骨組織比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表 2）

表2 骨肉瘤患者骨肉瘤組織和正常骨組織中miRNA-30家族成員相對表達量的比較

2.2 骨肉瘤組織中miRNA-30家族成員陽性表達率的比較

原位雜交實驗檢測結果顯示，miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e三種探針在骨肉瘤組織中均顯示為藍色的陰性顆粒；而在正常成骨組織中，顯示為棕色顆粒或者團塊（圖1）。骨肉瘤組織中 miRNA-30a、miRNA-30c和 miRNA-30e的陽性表達率均明顯低于正常骨組織，差異均有統計學意義（P＜0.01）（表3）。

圖1 原位雜交檢測骨肉瘤患者骨肉瘤組織和正常骨組織中miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的表達情況（1%甲基綠染色，×200）

表3 骨肉瘤患者骨肉瘤組織和正常骨組織中miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e陽性表達情況的比較[n（%）]

2.3 不同臨床特征骨肉瘤患者骨肉瘤組織miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e陽性表達情況

不同性別、腫瘤部位和分化程度骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30a陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同Enneking外科分期、肺轉移情況和復發情況骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30a陽性表達率比較，差異均有統計學意義（χ2=26.182、19.269、28.303，P＜0.05）。不同性別、腫瘤部位、分化程度、肺轉移情況和復發情況骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30c陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同Enneking外科分期骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30c陽性表達率比較，差異有統計學意義（χ2=17.293，P＜0.05）。不同性別、腫瘤部位、分化程度、Enneking外科分期和復發情況骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30e陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；不同肺轉移情況骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30e陽性表達率比較，差異有統計學意義（χ2=2.172，P＜0.05）。（表4）

表4 不同臨床特征骨肉瘤患者骨肉瘤組織miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e陽性表達情況（n=32）

2.4 不同miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e表達情況骨肉瘤患者生存情況的比較

miRNA-30a、miRNA-30c陽性表達骨肉瘤患者平均生存時間均長于miRNA-30a、miRNA-30c陰性表達骨肉瘤患者，差異均有統計學意義（t=5.82、3.87、P＜0.05）；miRNA-30e陽性表達與陰性表達骨肉瘤患者平均生存時間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（表5）

2.5 骨肉瘤患者預后影響因素的單因素分析

不同miRNA-30e表達情況骨肉瘤患者3年生存率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同miRNA-30a表達情況、miRNA-30c表達情況、Enneking外科分期、肺轉移情況和復發情況骨肉瘤患者3年生存率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表 6）

表5 不同miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e表達情況骨肉瘤患者的生存情況（月，±s）

表5 不同miRNA-30a、miRNA-30c和miRNA-30e表達情況骨肉瘤患者的生存情況（月，±s）

指標m i R N A-3 0 a表達陽性（n=5）陰性（n=2 7）m i R N A-3 0 c表達陽性（n=7）陰性（n=2 5）m i R N A-3 0 e表達陽性（n=8）陰性（n=2 4）4 1.3±4.2 2 8.2±1.6 3 9.7±5.1 2 4.9±2.2 2 9.7±1.8 3 5.1±3.5生存時間

表6 骨肉瘤患者預后影響因素的單因素分析（n=32）

2.6 骨肉瘤患者預后影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統計學意義的miRNA-30a表達情況、miRNA-30c表達情況、Enneking外科分期、肺轉移情況和復發情況作為自變量，骨肉瘤患者生存情況作為因變量納入Cox分析，結果顯示，miRNA-30a陰性表達和發生肺轉移是骨肉瘤患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。（表7）

表7 骨肉瘤患者預后影響因素的多因素Cox分析（n=32）

3 討論

目前，多項研究探討了miRNA家族在骨肉瘤表達中的意義。Hong等[16]分析了血清miRNA-29家族成員表達水平在骨肉瘤篩查中的作用，結果表明，miRNA-29家族能夠作為高級別骨肉瘤篩查的標志物，但作為低級別骨肉瘤篩查的靈敏度和特異度不足。miRNA-30家族以不同方式參與多種腫瘤的發生發展過程，可通過下調防止腫瘤發生的蛋白的表達發揮致癌因子的作用，又可作為抑癌因子抑制原癌基因蛋白的表達。miRNA-30a在滑膜肉瘤和視網膜母細胞瘤中表達上調，而在非小細胞肺癌和骨肉瘤中表達下調。miRNA-30a在卵巢癌[8]、膀胱癌[9]、肝癌[10]、黑色素瘤[11]和皮膚鱗狀細胞癌[12]等腫瘤組織中表達下調。本研究結果顯示，骨肉瘤患者骨肉瘤組織中miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的相對表達量明顯低于正常骨組織。張汝益等[17]研究發現，骨肉瘤143B細胞株中miRNA-30a呈明顯低表達，并進一步研究發現，過表達的miRNA-30a可能抑制人骨肉瘤細胞的遷移、侵襲和活力，并部分通過抑制Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）的翻譯發揮作用，與本研究結果一致。此外，信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）是重要的轉錄因子，其表達通常在惡性腫瘤細胞中呈上調狀態。STAT3的主要作用是通過STAT3/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路引起炎性微環境的改變，其主要負責炎癥誘發腫瘤和抗腫瘤反應[17]。Chen等[18]通過研究膠質瘤發現，miRNA-30的表達水平與STAT3呈負相關，且STAT3可以激活正常細胞中miRNA-30b的表達并上調miRNA-30b的表達從而對STAT3的表達發揮負反饋的調節作用。這意味著miRNA-30可能通過下調STAT3的表達抑制腫瘤細胞的浸潤。

本研究首先采用熒光實時定量RT-PCR檢測了miRNA-30家族5種成員在骨肉瘤組織和正常骨組織中的表達情況，結果表明，骨肉瘤患者骨肉瘤組織中 miRNA-30a、miRNA-30c、miRNA-30e的相對表達量明顯低于正常骨組織，提示這3種miRNA-30家族成員可能在骨肉瘤中發揮抑癌基因作用。這一研究結果，與既往關于miRNA-30家族在其他腫瘤中的研究結果一致。

目前，熒光實時定量RT-PCR技術是檢測miRNA表達的常規方法，能夠檢測組織中極其微量的miRNA，但熒光實時定量RT-PCR技術不能對miRNA在組織和細胞中的表達進行定位分析。因此，本研究進一步采用原位雜交技術檢測這3種miRNA-30家族成員在骨肉瘤及正常骨組織中的表達情況，結果一方面與熒光實時定量RT-PCR技術結果一致，即這3種miRNA在骨肉瘤組織中低表達。

綜上所述，本研究結果顯示，miRNA-30a表達情況可能與骨肉瘤患者的性別、腫瘤部位及分化程度無關，與Enneking外科分期、復發情況及肺轉移情況有關；miRNA-30c表達情況可能與骨肉瘤患者的Enneking外科分期有關；miRNA-30e表達情況可能與骨肉瘤患者肺轉移情況有關。最后本研究采用單因素和多因素Logstic回歸分析探討影響骨肉瘤患者預后的危險因素，結果表明，miRNA-30a陰性表達和發生肺轉移情況是骨肉瘤患者預后的獨立危險因素。本研究結果顯示，miRNA-30a能夠抑制骨肉瘤發展，是預測骨肉瘤患者生存的潛在有效生物標志物和有效治療靶點。