纖維素和直鏈淀粉衍生物雙選擇體手性固定相的分離特性研究

張 珊，徐小琴，郝菊芳，何保江，柏正武*

1.武漢工程大學化學與環境學院，湖北 武漢430205;

2.中國煙草總公司職工進修學院，河南 鄭州450008；

3.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州450001

自從Henderson和Rule［1］報道了在柱色譜中用乳糖作為手性吸附劑進行對映體分離以來，經過不斷的探索與優化，多糖衍生物類手性固定相（chiral stationary phase，CSP）因其卓越的分離性能和廉價易得的制備原料而廣受歡迎［2-4］。其中，纖維素［5-6］和直鏈淀粉［7-8］的衍生物表現出更為優越的分離性能。不同的多糖衍生物對同一種手性化合物的手性分離性能往往有很大差別。為了擴大手性色譜柱的應用范圍，人們嘗試制備雙選擇體CSP，期望彌補單選擇體CSP在手性分離方面的不足。例如，Francotte等［9］將兩種纖維素衍生物混合制備了雙選擇體CSP，研究結果表明，基于纖維素衍生物的雙選擇體CSP的手性分離性能介于兩種相應的單選擇體CSP的手性分離性能之間。本課題組也曾研究過纖維素及直鏈淀粉衍生物雙選擇體CSP［10-12］，發現了一些手性分離性能較好的雙選擇體CSP，雖然這些CSP的應用范圍有所擴大，但總的來說分離性能沒有得到大幅度的提高。沈軍等［13］制備了直鏈淀粉及纖維素衍生物混雜的復合型CSP，與單選擇體CSP相比，所制備的復合型CSP對一些手性樣品有更好的分離性能。

在研究中，我們意識到對于多糖衍生物雙選擇體CSP來說，其手性分離性能的改善程度主要取決于多糖衍生物結構的組合，即用不同組合的多糖衍生物共混制備CSP，其手性分離性能的改善情況也不相同。一些用纖維素衍生物［如纖維素-三（對基甲苯甲酸酯），cellulose tris（4-methylbenozate），CMB］和直鏈淀粉衍生物［如直鏈淀粉-三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯），amylose tris（3，5-dimethylphenylcarbamate，ADMPC）］制備的單選擇體CSP有較強的手性識別性能，其手性固定相和色譜柱已經商業化。為發掘分離性能更強的雙選擇體CSP，本文將CMB和ADMPC以等摩爾（重復單元摩爾數）共混，以此共混物制備涂覆型CSP，考察其與相應單選擇體CSP相比較手性分離性能提高的程度。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

對甲基苯甲酰氯、3-氨丙基三乙氧基硅烷（中國Aladdin試劑公司）；間二甲基苯異氰酸酯（中國濮陽宏大圣導有限公司）；手性樣品由國內諸多生產企業友情贈送或購自希恩斯試劑公司（中國天津）；大孔硅膠（平均粒徑7μm，日本Daiso公司）；用作色譜流動相的有機溶劑（中國國藥集團化學試劑有限公司）。

安捷侖1100型高效液相色譜儀（美國安捷侖公司）；Vario EL III CHNOS型元素分析儀（德國Elementar公司）；奧泰克1666型色譜柱填充泵（美國奧泰克公司）；色譜柱（i.d.250 mm×4.6 mm，英國Hypersil公司）。

1.2 雙選擇體CSP的制備

1.2.1 CMB和ADMPC的制備按文獻方法制備CMB［14］，產率96%，元素分析（%）：計算值C 69.77，H 5.43；實測值C 69.73，H 5.58。ADMPC在前期工作中制備，并對其進行了表征［12］，產率82%。

1.2.2 CSP的制備將3-氨丙基三乙氧基硅烷與大孔硅膠加入甲苯中，于95℃下反應過夜，用丙酮抽 提24 h，得 到 氨 丙基硅膠［15］。并 將0.565 1 g（1.09 mmol重復單元，下文同）CMB置于DMF（30 mL）中，攪拌至CMB完全溶解。取3 g氨丙基硅膠與10 mL CMB溶液相混合，減壓下加熱蒸干，完成一次涂覆，用余下的20 mL CMB溶液再進行兩次涂覆，得到涂覆著CMB的固定相（CSP1）。同樣地，將0.660 4 g（1.09 mmol）ADMPC涂覆于3 g氨丙基硅膠上，制得涂覆著ADMPC的固定相（CSP2）。將0.282 5 g（0.54 mmol）CMB和0.330 2 g（0.54 mmol）ADMPC加入30mL DMF中，攪拌，得到CMB―ADMPC混合液，用制備CSP1的方法，制得雙選擇體固定相（CSP3）。

1.3 手性柱的填充及色譜條件

將約為3.0 g的CSP置于30 mL正己烷/異丙醇（2/1，體積比，下同）中，超聲，使之成為勻漿液，在38 MPa的壓力下，以正己烷為頂替液，用填充泵將固定相壓入空色譜柱中，制得手性柱。以聯苯為樣品、正己烷/異丙醇（90/10）為流動相，紫外檢測器的波長設為254 nm，測試手性柱的柱效；以均三叔丁基苯為樣品測定死時間（t0）；用乙醇配制手性樣品溶液，其濃度為1 mg/mL，樣品溶液用0.2μm濾頭過濾，進樣體積設置為10μL；在分析檢測中，色譜儀的流速設為1.0 mL/min，柱溫箱的溫度設為25℃。色譜參數包括：保留因子（k1、k2）、分離因子（α）及分離度（Rs）。其中，k1=（tR1-t0）/t0、k2=（tR2-t0）/t0，tR1和tR2分別是先后被洗脫對映體的保留時間；α=k2/k1，Rs=2（tR2-tR1）/（w1+w2），w1和w2為兩個對映體的峰寬。

2 結果與討論

2.1 單選擇體與雙選擇體CSP分離性能的比較

圖1測試分離性能的手性樣品Fig.1 Chiral analytes for testing enantioseparation capabilities

在相同的流動相條件下，用37種結構不同的手性樣品（圖1）對三種CSP的手性分離性能進行評價，表1列出了各CSP對各個手性樣品在取得最大分離度條件下的色譜分離結果。如表1所示，單選擇體固定相CSP1、CSP2分別識別了26和28種手性樣品對映體，基線分離了其中的18和20種；CSP3識別了35種手性樣品對映體，基線分離了其中的22種。從所手性識別和基線分離的手性樣品數目來看，在分離性能方面，CSP2略好于CSP1，而雙選擇體固定相CSP3顯著地比CSP1和CSP2有更好的分離性能。在37種手性樣品中，有11種是手性藥物（手性樣品1-4、6、7、9-11、36和37），有4種是手性藥物中間體（手性樣品5、8、13和14），這些手性化合物均能被CSP3不同程度地分離，而手性藥物（或藥物中間體）8、10、13和36未被CSP1和CSP2分離，表明CSP3在手性藥物分析中有實際應用價值。另外，還發現手性樣品1-3、5、6、12、14、23、25和37在CSP3上能被更好地分離；而17、18和21號樣品在CSP1和CSP2上有更大的分離度。

上述現象可能與雙選擇體固定相中兩種選擇體在手性識別中存在協同或者反協同的作用有關。當兩種選擇體共混后，每一選擇體的高級結構在一定程度上仍然保持著原有的獨立性，因CSP3上有纖維素和直鏈淀粉兩種衍生物，它們各自能識別一定范圍的手性樣品，所以，CSP3的手性識別性能得到顯著提高。另一方面，CSP3上的纖維素和直鏈淀粉衍生物之間又有相互作用，對其原有的高級結構會有一定的改變，而改變后的高級結構對一些手性樣品的分離有利，表現出協同作用，同時也會對另一些手性樣品的分離不利，就表現為反協同作用。究竟是協同作用還是反協同作用為主，就要取決于兩種手性選擇體在結構上的搭配。結果表明，CMB和ADMPC的組合適合用于制備雙選擇體CSP，這種CSP的分離性能得到明顯增強。

2.2 流動相對雙選擇體CSP分離的影響

表2列出了CSP3在含不同醇的流動相中的手性分離結果。由表2可知，手性樣品5、6、8、11、13、15、19、20、22、28、30、31和35在含異丙醇的流動相中分離度最大，在含乙醇的流動相中次之，在含混合醇［（V（甲醇）/V（乙醇）=1/1］的流動相中最小；7、10、14、16、17、21、23、24、34和36在含乙醇的流動相中分離度最大，在含混合醇的流動相中次之，在含異丙醇的流動相中最小；4、25、29和37在含混合醇的流動相中分離度最大，在含異丙醇的流動相中最小。

表2流動相*中醇的組成對CSP3分離結果的影響Tab.2 Influence of alcohol compositions in mobile phases on enantioseparations of CSP3

圖2顯示了25和31號手性樣品在含異丙醇、乙醇和混合醇三種流動相中被CSP3分離的色譜圖，在正己烷/異丙醇（90/10）的流動相中，25和31號化合物在CSP3上的分離度分別為7.14和4.10，而在正己烷/甲醇/乙醇（90/5/5）的流動相中，分離度則分別為10.6和3.35，流動相中的醇對這兩個化合物的手性分離表現出相反的影響趨勢。這可能是因為在手性分離中，流動相中的醇也參與手性樣品的一對對映體與手性選擇體之間形成兩個非對映體的瞬時“復合物”，如果這兩個“復合物”的穩定性不同就可能產生手性識別，而流動相中醇的結構和極性都會影響兩個“復合物”的穩定性，所以，對于結構不同的樣品適合在含不同醇的流動相中進行分離。

圖2 25和31號手性化合物在CSP3上的分離色譜圖Fig.2 Enantioseparation chromatograms of chiral compounds 25 and 31 separated by CSP3

3 結論

盡管一些纖維素及直鏈淀粉衍生物CSP有較強的對映體分離性能，但還是有不少手性化合物不能被這些CSP所分離，如果能用廉價的原料就能制備出手性分離性能更強的CSP將有重要的意義。纖維素及直鏈淀粉經過一步反應就能生成CMB和ADMPC，用它們的共混物制備而成的雙選擇體CSP比兩種相應的單選擇體CSP能識別和基線分離更多的手性樣品，顯示出非常好的手性分離性能，因而這種CSP有很好的應用前景。本文結果表明，CMB和ADMPC這種組合適合用來制備高性能的手性分離材料。此外，根據色譜分離結果，推測流動相中的醇可能參與了手性樣品對映體與手性選擇體之間的相互作用，所以醇的結構對CSP3的手性分離有較大的影響。