丁香酚納米顆粒的制備及其最優化條件

劉 港，李星宇，游 峰，成鴻靜，梅 軍，鄭華明

武漢工程大學材料科學與工程學院，湖北 武漢430205

丁香酚（eugenol，EG）是從丁香中提取的一種天然植物性酚類精油（4-烯丙基-2-甲氧基苯酚），由于其具有超強的抗菌和抗氧化性而引起了人們的廣泛關注［1］。但EG難溶于水，常溫下極易揮發，限制了其在實際生產中的應用［2］。為提高該類物質的穩定性，避免其在儲存和使用過程中失活，近年來出現了納米封裝技術［3］。玉米醇溶蛋白（zein）中含大量的非極性氨基酸，在結構上具有親水性頂部和疏水外表面，這使得它具有獨特的溶解特性［4］。由于其特殊結構和兩親性屬性，可以利用zein裝載控制生物分子［5］。此外，zein是美國食品藥品監督管理局批準的可用于食品加工過程中的少數幾種疏水性材料之一［6］，已被廣泛用于封裝維生素E、葡萄籽提取物、精油等生物活性化合物的技術中［7］。Woranuch等［8］通過乳液-離子凝膠交聯法將EG包封到殼聚糖納米顆粒中，以此改善熱塑性淀粉的耐氧化性。結果顯示：在含有同等活性物質量的條件下，相較于含純EG的熱塑淀粉，含EG納米顆粒的熱塑淀粉受熱后，其殘余EG量是前者的8倍，在自由基清除活性方面后者是前者的2.7倍。Marco等［2］采 用pH和 加 熱 誘 導 制 備zein-酪蛋白酸鈉-果膠復合物包封EG，并用噴霧干燥使其能以粉末狀長期穩定存在，從而在食品工業中具有更大的應用潛力。Donsi等［6］發現酪蛋白酸鈉可提高玉米黃酮膠體顆粒對表沒食子兒茶素的包封率和穩定性。隨著人們生活質量的提高，人們越來越關注食品的營養性及功能性，大量生物活性成分已被廣泛應用于各類食品體系。但這類物質中大多數的生物可及性及生物可利用度均較低，特別是各種疏水性生物活性物質，包括脂溶性維生素（A、D、E）、多不飽和脂肪酸（EPA、DHA及CLA）、類胡蘿卜素和疏水性植物多酚（茶多酚、姜黃素、異黃酮等），如何在食品中有效添加并保持其穩定性仍然是目前食品工業的一大技術難題。

為提高EG的穩定性和可利用性，本文通過反溶劑沉淀法［9］，用zein對EG進行包封，并加入阿拉伯膠（Arabic gum，AG），利用其吸附在zein納米粒上，通過靜電和疏水相互作用，增強復合顆粒的結構穩定性［10］。通過改變zein、EG和AG三者的質量比，以及zein的質量濃度，成功制備出zein-EG-AG復合納米顆粒，并以包封率為主要考察指標，使用響應面分析軟件Design-Expert對其制備工藝進行了優化。

1 實驗部分

1.1 材料與設備

Zein（北京索萊寶科技有限公司）；EG、AG（上海阿拉丁試劑有限公司）；福林酚試劑（上海麥克利生化科技有限公司）；其他試劑（分析純，國藥集團試劑有限公司）；紫外分光光度計（Lambda35，Perkin Elmer）。

1.2 復合納米顆粒的制備

參照文獻［11］，將zein和EG分別溶解在體積分數為80%的乙醇水溶液中，并以一定比例將兩者混合。取3 mL混合液，在高速攪拌逐滴加入到9 mL水中，固化5 min。45℃旋蒸5 min，除去乙醇。加水補充至原體積，調節pH為4.0。再將其加入到12 mL、pH為4.0的AG溶液中，繼續攪拌10 min，即得復合納米顆粒分散液。

1.3 復合納米顆粒包封率的測定

參照文獻［12］，取2 mL上述復合納米顆粒分散液，加入到8 mL無水乙醇中，渦旋振蕩3 min。參考文獻［6］采用福林酚試劑法檢測丁香酚含量：取0.3 mL上述溶液，加入1.2 mL H2O和0.3 mL福林酚試劑，室溫下反應10 min，再加入1.2 mL質量分數為7.5%的NaCO3溶液，靜置2 h，在765 nm處檢測溶液的吸光度。根據公式E=1-m1/m0計算包封率（m1為測得溶液中EG的游離量，mg；m0為處方中加入的EG總量，mg）。

1.4 單因素試驗設計

采用反溶劑沉淀法制備復合納米顆粒，研究zein與EG的質量比［m（zein）∶m（EG）］（10∶1，5∶1，3∶1，1∶1，1∶3）、zein與AG的 質 量 比［m（zein）∶m（AG）］（5∶1，1∶1，1∶5，1∶10）和zein的質量濃度（1.250，1.875，2.500，3.125，3.750 mg/mL）對復合納米顆粒包封率的影響。

1.5 復合納米顆粒響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析軟件Design-Expert中 的Box-Behnken設 計，考 察m（zein）∶m（EG）（A）、m（zein）∶m（AG）（B）、zein的質量濃度（C）3個因素對復合納米顆粒包封率工藝參數進行優化，其因素水平見表1。

表1復合納米顆粒包封率的響應面試驗因素及水平Tab.1 Test factors and levels of response surface of encapsulation efficiency of composite nanoparticles

1.6 數據統計與分析

所有試驗數據用Excel進行初步整理，并用Origin 8.0作圖；采用Box-Behnken設計響應面試驗，結合Design-Expert8.0軟件進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 不同影響因素下復合納米顆粒的包封率

2.1.1 Zein與丁香酚的質量比對復合納米顆粒的包封率的影響保持m（zein）∶m（AG）=1∶1，zein質量濃度=2.500 mg/mL不變，探究zein與EG的質量比對復合納米顆粒包封率的影響，結果如圖1（a）所示，隨著EG的相對含量增加，納米粒子對EG的包封率先增加后減小。其原因可能是zein含有2/3的α螺旋結構和1/3的β折疊結構，具有一定的親水親油能力，EG能夠締合于zein的疏水微區［13］。在EG含量較低時，所形成的納米粒子空腔體積較小，與zein結合的位點相對較少，對EG的包埋量就會變小；當m（zein）∶m（EG）=5∶1時，zein的量足夠負載EG，并且所形成的納米粒子空腔體積也相對合適，此時包封率最大；m（zein）∶m（EG）＜5∶1時，隨著EG含量繼續增大，zein的負載能力下降［14］，游離的EG量將增多，故包封率下降。

2.1.2 Zein與阿拉伯膠的質量比對復合納米顆粒的包封率的影響保持m（zein）∶m（EG）=5∶1，zein質量濃度為2.500 mg/mL不變，探究zein與AG的質量比對復合納米顆粒包封率的影響，結果如圖1（b）所示。當m（zein）∶m（AG）＞1∶5，在pH 4.0時由于zein帶正電荷，AG帶負電荷，二者靜電絡合，隨AG量增加，顆粒結構更加穩定，包封率增大；AG量繼續增加，體系黏度增加，阻礙體系反應進行，包封率下降［15］。

2.1.3 Zein濃度對復合納米顆粒的包封率的影響保持m（zein）∶m（EG）=5∶1，m（zein）∶m（AG）=1∶5不變，探究zein的質量濃度對復合納米顆粒包封率的影響。結果如圖1（c）所示，zein質量濃度低于20 mg/mL時，隨zein質量濃度增大，能被包埋的EG增多，包封率增大，zein質量濃度進一步增大后，zein自組裝成中空粒子與形成復合納米顆粒產生競爭［16］，故包封率下降。

圖1影響包封率的因素：（a）zein與EG質量比，（b）zein與AG質量比，（c）zein質量濃度Fig.1 Effects of factors on encapsulation efficiency：（a）mass ratio of zein/EG，（b）mass ratio of zein/AG，（c）mass concentration of zein

2.2 復合納米顆粒包封率的響應面試驗

2.2.1 回歸模型的建立在單因素試驗結果基礎上，根據Box-Behnken設計17組試驗，試驗設計與結果見表2。

表2響應面試驗設計及結果Tab.2 Test design and results of response surface

利用Design-Expert8.0軟件對表2試驗數據進行二次回歸擬合，得到復合納米顆粒的包封率（Y）對m（zein）∶m（EG）（A）、m（zein）∶m（AG）（B）和zein質量濃度（C）3個因素之間的回歸模型為：

由表3可知，模型P＜0.01，說明Y與A、B、C的回歸方程關系極顯著，即模型極顯著。根據結果分析，各因素對復合納米顆粒包封率的影響依序為：m（zein）∶m（AG）＞zein質量濃度＞m（zein）∶m（EG）。

表3回歸模型方差分析Tab.3 Analysis of variance of regression model

2.2.2響應曲面圖以及等高線圖根據回歸方程繪制響應面曲線圖及等高線圖，考察zein與EG的質量比（A）、zein與AG的質量比（B）、zein質量濃度（C）3個因素的交互作用。由圖2可知：AB、AC的交互作用圖為橢圓，且P＜0.001，交互作用及其顯著［17］。而BC的P值雖然小于0.05，但交互作用圖接近圓形，交互作用的顯著性較差。

圖2各因素交互作用對包封率影響的響應面及等高線圖：（a1，a2）zine與EG質量比和zein與AG質量比，（b1，b2）zine與EG質量比和zein質量濃度，（c1，c2）zein與AG質量比和zein質量濃度Fig.2 Response surfaces and contour plots of encapsulation efficiency caused by interaction of various factors：（a1，a2）mass ratio of zein to eugenol and zein to gum arabic，（b1，b2）mass ratio of zein to eugenol and mass concentration of zein，（c1，c2）mass ratio of zein to gum Arabic and mass concentration of zein

2.2.3 模型預測最優方案及其驗證模型預測的復合納米顆粒最大包封率為59.56%，該條件下的工藝參數為：m（zein）∶m（EG）=5.23，m（zein）∶m（AG）=0.23，zein質量濃度為2.63 mg/mL。在此工藝參數下制備丁香酚納米顆粒，對該模型下的預測值進行驗證。該條件下丁香酚納米顆粒的實際包封率為60.90%，與模型預測值極為接近，說明該模型具有一定的可靠性。

3 結論

通過響應面分析研究了zein與EG的質量比、zein與AG的質量比、zein質量濃度對復合納米顆粒包封率的影響，并得到包封率與試驗參數相關的數學模型。方差分析結果表明，所得模型高度顯著（P＜0.01），并對復合納米顆粒包封率進行工藝優化。優化結果顯示，m（zein）∶m（EG）=5.23、m（zein）∶m（AG）=0.23、zein質量濃度為2.63 mg/mL時，對應包封率為59.56%。在此條件下制備樣品，實際測得包封率為60.90%，結果相近，表明該模型具有很好的可靠性。該研究為丁香酚及其它疏水性生物活性物質在現代食品工業生產中的應用起到一定的理論指導意義。